基于PPARγ/LXR-α信号通路探讨槲皮素对急性肺损伤肺泡巨噬细胞胞葬功能影响机制

杨昊若,樊茂蓉,杨 斌

(1. 天津中医药大学,天津 301617;2. 中国中医科学院西苑医院,北京 100091)

急性肺损伤是临床上常见的呼吸系统危重疾病,以中性粒细胞等炎症细胞大量聚集、炎性及趋化因子释放过量,引起持续弥漫性肺部炎症为典型病理特征[1],病情演进迅速,可快速发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)而危及患者生命,因而完善并挖掘急性肺损伤的致病机制及治疗靶点十分重要。急性肺损伤的发病实质是过度的炎症反应,可分为急性炎症期和炎症消退期。在急性炎症期,大量炎性细胞浸润肺组织,分泌过量的炎性细胞因子,引发炎症因子风暴,损伤肺毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞,导致肺功能下降[2]。在炎症消退期,肺泡巨噬细胞可吞噬凋亡的中性粒细胞等炎症细胞,同时促进肺上皮及内皮功能恢复和肺组织结构的修复,这一现象称为胞葬作用[3]。而凋亡细胞未被及时清除时,细胞内各种自身抗原及炎性介质释放可加重炎症反应,进一步损伤肺组织[4]。由此可见,肺泡巨噬细胞的胞葬作用可有效抑制过度炎症反应,并能协助肺组织的重建,减轻肺损伤,因而维持肺泡巨噬细胞的胞葬功能正常对于改善急性肺损伤非常重要。过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)/肝X受体α(LXR-α)信号通路是与体内炎症、脂质代谢、氧化应激相关的重要通路,促进该通路激活可有效抑制炎性介质及氧自由基的释放[5]。此外,由PPARγ介导的信号通路可调节多种胞葬相关因子的表达,以实现对胞葬作用的调控[6]。因此,若能通过激活PPARγ/LXR-α通路并以此增强肺泡巨噬细胞的胞葬功能,或是减轻急性肺损伤的有效途径。槲皮素具有抗炎、抗氧化等作用,可有效抑制急性肺损伤过度炎症反应,减轻肺组织损伤[7],但其作用机制尚不明确。本研究采用腹腔注射脂多糖建立急性肺损伤大鼠模型,通过观察槲皮素对肺泡巨噬细胞胞葬功能和PPARγ/LXR-α信号通路的影响,探讨了槲皮素治疗急性肺损伤的潜在作用机制。

1 实验材料和方法

1.1动物 健康成年雄性SPF级SD大鼠60只,体重150～200 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0001。大鼠饲养于中国中医科学院西苑医院实验中心动物房,温度20～24 ℃,湿度40%～60%。动物实验程序经中国中医科学院西苑医院实验动物管理和使用委员会审查批准,动物伦理批准号：2021XLC015-1。

1.2药品与试剂 槲皮素(纯度98%,美国Sigma,货号：PHR1488);酸醋地塞米松片(上海Beyotime,规格：100 mg/片);脂多糖(美国Sigma-Aldrich,批号：065M8209V);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(武汉elabscience,批号分别为E-EL-R2856c、E-EL-R0012c、E-EL-R0015c、E-EL-R0016c);苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京Solarbio,货号：G1120);原位末端转移酶标记法(TUNEL)染色试剂盒(美国CST,货号：#25879);4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染色液(武汉elabscience,货号：E-CK-A163);PBS缓冲液(上海Beyotime,货号：C0221a);PKH26膜标记探针(上海Beyotime,货号：C1031);台盼蓝(上海Beyotime,货号：ST2780-25g);胰酶细胞消化液(上海Beyotime,货号： C0201-100ml);PPARγ兔单克隆抗体、LXR-α兔多克隆抗体、CD68兔多克隆抗体(武汉elabscience,货号分别为E-AB-70253、E-AB-70218、E-AB-70389);辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠/兔IgG二抗(北京中杉金桥,货号：PV6000)。

1.3仪器 MLS-3750型全自动高压灭菌器(日本三洋);RM2016型病理切片机(德国Leica);TPl020型全自动脱水机(德国Leica);Olympus BX53型显微镜(日本Olympus);FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD);Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics);JK-6型烤片机;C250 V型微型高速离心机(美国Labnet);ICV-450型电热恒温培养箱(日本Asone);Flex Station 3型酶标仪(美国Molecular Devices)。

1.4实验方法 将60只SD大鼠随机分为6组,每组10只。槲皮素低、中、高剂量组分别于造模前给予10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的槲皮素灌胃(给药剂量参照文献[8]及前期预实验结果确定),地塞米松组给予5 mg/kg的地塞米松灌胃(给药剂量根据人体与动物等效剂量体表面积法换算),正常组和脂多糖组给予等量生理盐水灌胃,均1次/d。连续灌胃14 d后,除正常组给予生理盐水腹腔注射外,其余组均参考文献[9],采用鼻滴法给予脂多糖50 μg建立急性肺损伤模型。 约造模后2 h大鼠开始出现高热、呼吸急促等表现即代表造模成功。造模成功24 h后,各组大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉取材。

1.5检测指标及方法

1.5.1肺泡巨噬细胞胞葬功能 于超净台分离大鼠气管,PBS注入肺内进行肺泡灌洗。灌洗液离心,重悬,置于完全培养基中培养,收集贴壁细胞,流式鉴定大鼠肺泡巨噬细胞。同时紫外线开盖照射,30 000 J/cm2,15 min,诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡,照射结束后,流式细胞仪检测细胞凋亡率,凋亡细胞使用PKH26膜标记探针染色。肺泡巨噬细胞接种于培养皿,贴壁后加入PKH26染色的凋亡Ⅱ型肺泡上皮细胞,培养箱孵育30 min,0.4%台盼蓝混匀,孵育1 min,加入胰酶细胞消化液,收集,离心,检测荧光强度。肺泡巨噬细胞携带的平均荧光强度代表其吞噬凋亡细胞的能力,即胞葬功能。

1.5.2肺组织细胞凋亡情况 取肺组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,4 μm切片,PBS洗涤,通透样本后,滴加TUNEL试剂(TdT酶∶荧光素标记dUTP=1∶9)。切片置于湿盒内, 37 ℃孵育1 h,滴加DAPI,避光室温孵育10 min,PBS洗涤2次,每次5 min,荧光显微镜摄片并计算凋亡指数。

1.5.3血清炎症介质水平 腹主动脉采血,静置30 min后,2 000 r/min离心10 min,分离血清。ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平,具体操作严格依照相应试剂盒说明书进行。

1.5.4肺组织病理学形态 取肺组织,4%多聚甲醛固定24 h,石蜡包埋,4 μm切片,常规HE染色后光镜下观察。

1.5.5肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68蛋白表达情况 采用免疫组织化学法检测：取石蜡包埋肺组织,4 μm切片,70 ℃烤片1 h,二甲苯、梯度乙醇脱蜡,3%H202避光15 min,枸橼酸盐修复液(pH 6.0)高压热修复3 min,分别滴加PPARγ、LXR-α、CD68抗体(浓度分别为1∶500,1∶500,1∶400),4 ℃孵育过夜。次日加二抗,常温孵育30 min,DAB显色,镜下控制反应时间,染色完成后自来水冲洗,苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。光镜下观察,阳性为肺组织内出现淡黄至棕黄色颗粒,每张切片随机取5个高倍视野(×400),Image-Pro Plus 6.0软件测定阳性信号的平均光密度值。

1.5.6肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68 mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测：PPARγ、LXR-α、CD68mRNA与内参基因GAPDH引物使用Primer5.0软件设计,上海生工股份有限公司合成。PPARγ上游引物序列为5’-TCCCGTTCACAAGAGCTGAC-3’,下游引物序列为5’-ATAATAAGGCGGGGACGCAG-3’,扩增长度107 bp;LXR-α上游引物序列为5’-GATGTTCCCACGGATGCTA-3’,下游引物序列为5’-CTC CTCAGTCTGCTCCACCT-3’,扩增长度109 bp;CD68上游引物序列为5’-CCTGACAAGGGACACTTCGC-3’,下游引物序列为5’-ATTGTCGTCTGCGGGTGATG-3’,扩增长度139 bp; GAPDH上游引物序列为5’-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3’,下游引物序列为5’-AAGGTGGAAGAATGGGAGTT-3’,扩增长度308 bp。提取细胞总RNA,反转录后取cDNA。使用20 μL体系,正反向引物各0.8 μL,cDNA 2 μL,双氧水6.4 μL扩增,95 ℃预变性3 min,95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,总计40个循环。采用2-△△CT计算PPARγ、LXR-α、CD68 mRNA相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能 与正常组比较,脂多糖组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能明显减弱(P<0.05);与脂多糖组比较,槲皮素各组及地塞米松组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能均明显增强,并与槲皮素呈现剂量依赖关系,差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1。

图1 正常组和急性肺损伤各组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能比较

2.2各组大鼠肺组织细胞凋亡情况 正常组在荧光显微镜下基本无TUNEL染色阳性细胞,细胞凋亡率为4.78%; 脂多糖组TUNEL染色阳性细胞数量明显增多,细胞凋亡率为45.1%,明显高于正常组(P<0.05);槲皮素低、中、高剂量组及地塞米松组TUNEL染色阳性细胞数量较脂多糖组明显减少,细胞凋亡率分别为27.8%,19.6%,10.3%,17.4%,均明显低于脂多糖组(P均<0.05);槲皮素各剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2。

图2 正常组和急性肺损伤各组大鼠肺组织细胞凋亡情况(TUNEL染色,×200)

2.3各组大鼠血清炎症介质水平 与正常组比较,脂多糖组血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显升高,血清IL-10水平明显降低,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与脂多糖组比较,槲皮素各剂量组及地塞米松组血清TNF-α、IL-1β水平和槲皮素中、高剂量组及地塞米松组血清IL-6水平均明显降低,槲皮素各剂量组血清IL-10水平均明显升高,差异均有统计学意义(P均<0.05);且槲皮素高剂量组血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显低于槲皮素低剂量组,血清IL-10水平明显高于槲皮素低剂量组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和急性肺损伤各组大鼠血清炎症介质水平比较

2.4各组大鼠肺组织病理形态 正常组肺泡细胞结构完整,肺泡壁光滑,肺泡腔及间质内无渗出,未见明显炎细胞浸润;与正常组比较,脂多糖组肺泡腔及间质内白细胞渗出、浸润,肺泡腔内见渗出液,肺泡隔增厚,肺泡及间质充血,部分肺泡塌陷、不张、透明膜形成,炎性细胞弥漫浸润,肺组织病理损伤严重;槲皮素中、低剂量组及地塞米松组肺泡细胞排列无序、细胞轻度肿胀,坏死区较脂多糖组明显减少,炎细胞呈多灶性浸润;槲皮素高剂量组细胞排列轻度不规整,肺泡细胞轻度肿胀,肺泡隔增厚、间质充血程度减轻,炎细胞浸润数量较槲皮素中、低剂量组及地塞米松组进一步减少。见图3。

图3 正常组和急性肺损伤各组大鼠肺组织病理形态(HE染色,×100)

2.5各组大鼠肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68蛋白阳性表达情况 脂多糖组大鼠PPARγ、LXR-α、CD68阳性表达平均光密度值均明显低于正常组(P均<0.05);槲皮素中、高剂量组PPARγ阳性表达平均光密度值、槲皮素各剂量组LXR-α和CD68阳性表达平均光密度值、地塞米松组PPARγ和CD68阳性表达平均光密度值均明显高于脂多糖组(P均<0.05),槲皮素各剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4及表2。

表2 正常组和急性肺损伤各组大鼠肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68阳性表达平均光密度值比较

图4 正常组和急性肺损伤各组大鼠肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68阳性表达情况(免疫组化染色,×100)

2.6各组大鼠肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68 mRNA表达情况 脂多糖组PPARγ、LXR-α、CD68 mRNA相对表达量均明显低于正常组(P均<0.05);槲皮素各剂量组及地塞米松组PPARγ mRNA相对表达量和槲皮素中、高剂量组及地塞米松组LXR-α mRNA相对表达量、槲皮素各剂量组CD68 mRNA相对表达量均明显高于脂多糖组(P均<0.05),槲皮素各剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图5。

图5 正常组和急性肺损伤各组大鼠肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

急性肺损伤是由创伤、感染、脓毒症等多种因素引起的呼吸系统危重疾病,常伴随呼吸衰竭和顽固性低氧血症,病理特征表现为肺泡水肿、上皮细胞与内皮细胞间完整性破坏、肺泡腔有蛋白质渗入、炎症细胞聚集等[10]。炎症细胞在肺组织的浸润、渗透,分泌过量促炎介质,导致肺泡上皮与内皮细胞凋亡是急性肺损伤发病的始动因素,由大量促炎介质引起的炎症因子风暴是导致病情加重、难以控制的直接原因[11]。因此抑制肺部严重的炎症反应以减轻肺组织病理损伤是治疗急性肺损伤的有效策略。目前急性肺损伤的治疗多采用地塞米松、乌司他丁、泼尼松等药物,但疗效有限,且这些药物可引起凝血功能障碍、骨质疏松症等不良反应,因而亟待寻求有效、可靠的治疗方案。近年研究发现中医药治疗急性肺损伤具有多靶点、多途径、疗效确切、不良反应少等优势[12]。中医认为急性肺损伤早期以实证为主,中期虚实夹杂,晚期以虚证为主,整体呈现出虚实夹杂的特点,治法包括活血清热解毒、通里攻下、肺肠同治、扶正祛邪等。槲皮素是一种天然黄酮类化合物,是多种临床治疗急性肺损伤方药中的关键成分,其可通过减轻氧化应激介导的内质网应激发挥对急性肺损伤的保护作用[13-14]。

胞葬作用是指巨噬细胞等吞噬细胞清除程序性凋亡细胞的过程。正常情况下,巨噬细胞等吞噬细胞可在这些凋亡细胞的膜破裂、有毒细胞内容物释放到周围组织之前,将其快速安全清除,以保护周围组织免受损害。同时巨噬细胞吞噬凋亡细胞后,还会分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)等细胞因子抑制组织炎症的发生,促进坏死细胞的更新与组织损伤的修复。但吞噬细胞胞葬能力下降时,凋亡细胞无法得到及时清除,二次坏死后将进一步释放炎症介质,引起组织炎症,导致疾病的发生。而人体无论处在正常生理状态还是病理条件下,都将产生数以亿计的凋亡细胞[15]。由此可见,保证巨噬细胞等吞噬细胞的胞葬功能正常,对于维持机体内环境的稳态具有重要意义。肺泡巨噬细胞是肺部主要且关键的免疫细胞,其强大的吞噬功能可及时清除肺部的病原微生物、坏死或凋亡的细胞及细胞碎片,防止这些物质积累对肺部造成损伤。当肺泡巨噬细胞的胞葬功能受到抑制时,肺泡巨噬细胞对凋亡细胞清除作用明显减弱,对肺部病原微生物及中性粒细胞等炎性细胞的吞噬功能明显受损,促炎因子水平显著升高,直接导致肺部持续高炎症状态[16]。而持续的炎症反应是肺损伤不断演进的核心原因,因此认为维护肺泡巨噬细胞的胞葬功能正常,是抑制肺组织过度炎症反应,遏制肺损伤发生发展的有效手段。Li等[17]研究发现,通过增强肺泡巨噬细胞的胞葬功能,可降低炎症因子水平,减少中性粒细胞浸润和蛋白质渗出,改善急性肺损伤小鼠肺水肿等病理损伤。Ⅱ型肺泡上皮细胞异常凋亡是纤维化肺疾病的显著特征,其凋亡可引发炎症反应的持续加重[18]。本研究中选择紫外线诱导凋亡的Ⅱ型肺泡上皮细胞作为肺泡巨噬细胞吞噬的靶细胞,结果显示脂多糖组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能明显下降,肺组织细胞凋亡率及血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高,血清抑炎因子IL-10水平明显降低,肺组织中有大量炎细胞弥散性浸润,肺组织病理损伤严重;相比脂多糖组,槲皮素各组大鼠肺泡巨噬细胞的胞葬功能明显增强,肺组织细胞凋亡率和血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显降低,血清IL-10水平均明显升高,肺组织中炎细胞浸润减少,肺组织病理损伤明显改善。提示槲皮素可明显改善急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞的胞葬功能,抑制肺组织过度炎症反应,说明改善肺泡巨噬细胞的胞葬功能对于缓解急性肺损伤具有重要作用。

PPAR-γ/LXR-α信号通路与机体内炎症反应、氧化应激、细胞凋亡及脂质代谢等病理生理过程关系密切,可调控TNF-α、IL-1β、IL-6分泌,参与动脉粥样硬化、急性痛风性关节炎等多种炎性疾病的发生发展,该通路受抑是过度炎症反应及氧化应激发生的重要原因[19]。Huang等[20]研究发现,阻断PPARγ激活,可促进炎症因子TNF-α、IL-6表达,而PPARγ活化后,炎症因子表达减少。Zhang等[21]研究表明,通过上调PPARγ表达可明显减少脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中性粒细胞聚集和活性氧(ROS)积累,抑制炎症及氧化应激,改善小鼠肺组织病理损伤。此外PPARγ/LXR激活后还可上调胞葬相关受体和因子的表达,增强巨噬细胞吞噬凋亡细胞能力,减轻炎症反应,缓解急性肺损伤[22]。CD68是肺泡巨噬细胞的标志物,通过检测CD68表达可明晰肺泡巨噬细胞的数量[23]。Li等[24]研究表明,黄酮类化合物可有效促进PPARγ表达,而槲皮素是由植物衍生出的黄酮类化合物,抗炎、抗氧化作用突出,因此本课题组推测槲皮素对急性肺损伤的治疗作用可能是通过激活PPARγ/LXR-α信号通路实现的。本实验结果显示,模型组大鼠肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68蛋白阳性表达情况及mRNA相对表达量均较正常组明显降低,而槲皮素各组肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68蛋白阳性表达情况及mRNA相对表达量均高于模型组,结合肺组织细胞凋亡率、肺泡巨噬细胞胞葬功能和肺组织炎症及病理损伤情况,提示槲皮素可激活PPARγ/LXR-α信号通路,增强肺泡巨噬细胞胞葬功能,进而抑制过度炎症反应,修复肺组织结构。

综上所述,槲皮素可提高脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能,降低血清炎症因子水平,抑制炎症因子风暴发生,减轻肺组织炎症反应及其造成的病理损伤,其机制可能与激活PPARγ/LXR-α信号通路有关。本研究为中药治疗急性肺损伤等肺部呼吸疾病提供了一定理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。