芍药苷对小鼠放射性肠炎的防治作用

陈美丽,杨 艳,马亚军,刘宝瑞,钱晓萍,杨 觅

(1. 南京医科大学附属江宁医院,江苏 南京 211100;2. 南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心暨南京大学临床肿瘤研究所,江苏 南京 210008)

放疗是目前肿瘤治疗的重要手段之一,2020年《全球癌症统计报告》数据显示,约70%的恶性肿瘤患者在疾病发展的不同阶段需要接受放疗[1],包括术前新辅助放疗、术后辅助放疗、放化疗联合及晚期姑息减症性放疗等。放射性肠炎是腹腔和盆腔肿瘤放疗后的常见并发症,急性放射性肠炎多发生在放疗后3个月内,主要表现为腹痛、腹泻、里急后重、黏液血便等,其中有5%～20%的患者可迁延为慢性放射性肠炎。国际上2018年发布的“ASCRS慢性放射性直肠炎诊治指南”是迄今为止第一份放射性肠炎的诊治指南[2],我国也根据国内外研究情况和国人特点制定了一份符合中国实际情况的“中国放射性直肠炎诊治专家共识”[3],但仍有许多患者治疗效果不满意,甚至还伴随着一些治疗相关不良反应,所以临床迫切需求寻找有效治疗放射性肠炎的方法,以减轻患者症状,提高生活质量。芍药苷是芍药的重要组成成分,具有抗炎、镇静、镇痛、抗肿瘤、保肝、保护神经、免疫调节等作用,其毒性很低,正常情况下无明显不良反应,小鼠半数致死量静脉注射为3 530 mg/kg、腹腔注射为9 530 mg/kg[4-5]。本研究观察了不同剂量芍药苷腹腔灌注对小鼠放射性肠炎的防治作用,旨在为芍药苷防治放射性肠炎提供依据。

1 实验材料和方法

1.1实验动物 SPF清洁级C57/B6雌性小鼠60只,体重18～22 g,由扬州大学比较医学中心提供,实验动物使用许可证号：SCXK(苏)2012-0004,分笼饲养于南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤中心SPF级动物实验室,实验室保持温度(20±2)℃,60%相对湿度,自由饮水及标准饲料适应性喂养1周,符合相关动物实验伦理要求。

1.2主要药物及器材 水合氯醛(用蒸馏水配成10%溶液,由南京鼓楼医院动物房提供),芍药苷(纯度≥98%,由南京医科大学实验室提供),10%福尔马林溶液,生理盐水,南京鼓楼医院肿瘤中心放疗部直线加速器(10 MeV,德国西门子公司),超净工作台(苏州安泰),电子精密天平(奥豪斯仪器常州有限公司),自制的小鼠固定器,眼科剪(苏州市施强医疗器械有限公司),弯头镊(上海医疗器械集团有限公司手术器械厂),包埋机(常州康恩医疗器械有限公司),切片机(常州康恩医疗器械有限公司),苏木精-伊红染液(福州飞净生物科技有限公司)。

1.3实验方法 随机将小鼠分为6组,每组10只。各组小鼠禁食12 h(不禁水)后,采用水合氯醛(30 μL/10 g)腹腔注射麻醉,待小鼠肌肉完全松弛后取仰卧位固定于自制的小鼠固定架,正常组小鼠予以假照射,其余组小鼠均予以18 Gy 10 MeV电子线全腹部单次照射,照射范围为剑突至耻骨联合,源皮距100 cm,剂量率为260～300 MU/min,照射完毕等待小鼠苏醒后送返动物房。放疗操作过程在经验丰富的放疗科医生及技师指导下完成。在放疗前2 d、放疗当天及放疗后第1～13天,正常组和放疗+生理盐水组每天腹腔灌注生理盐水,放疗+地塞米松组每天腹腔灌注地塞米松1.25 mg/kg,放疗+芍药苷低剂量组、放疗+芍药苷中剂量组、放疗+芍药苷高剂量组分别每天腹腔灌注芍药苷30 mg/kg、60 mg/kg、90 mg/kg,灌注量均为0.1 mL/10 g,均1次/d。

1.4观察指标及方法 放疗后每天称重,观察小鼠排便(大便颜色、硬度,有无稀便、黏液脓血便)、自主活动(活动/静止、正常/蜷缩)及毛发(光滑/粗糙)情况。放疗后第2天、第4天、第6天、第8天、第14天解剖(解剖前禁食12 h,不禁水)各组小鼠,肉眼观察肠道大体情况(腹腔与肠道是否光滑无粘连、肠管是否扩张、颜色是否红润等),并取病变最明显处大肠、小肠组织进行HE染色病理观察。

2 结 果

2.1各组小鼠一般情况 放疗前各组小鼠排便正常,精神良好,进食及饮水等均正常。正常组小鼠和放疗后放疗+芍药苷高剂量组、放疗+芍药苷中剂量组小鼠排便均正常,肛周皮肤清洁,活动自如,毛发光滑;放疗+芍药苷低剂量组放疗后第4天有2只小鼠出现解黄色稀便伴肛周污垢,1只出现行动迟缓,小鼠陆续出现毛发粗糙;放疗+生理盐水组在放疗后第3天有5只小鼠出现解黄色稀便伴肛周污垢,第4天有2只小鼠出现行动迟缓,小鼠陆续出现毛发粗糙;放疗+地塞米松组在放疗后第4天有1只小鼠出现解黄色稀便伴肛周污垢,1只出现行动迟缓,小鼠陆续出现毛发粗糙。

2.2各组小鼠体重 放疗前2 d至放疗当天, 6组小鼠体重整体呈上升趋势;放疗后,除正常组外,其他组小鼠体重呈不同程度的下降趋势;放疗第14天,正常组、放疗+芍药苷高剂量组、放疗+芍药苷中剂量组、放疗+芍药苷低剂量组、放疗+地塞米松组、放疗+生理盐水组小鼠体重分别为(21.49±0.60)g、(19.73±0.60)g、(19.99±0.48)g、(16.83±1.92)g、(16.50±1.83)g、(15.77±2.20)g,各放疗组均明显低于正常组(P均<0.05),放疗+芍药苷高剂量组、放疗+芍药苷中剂量组均明显高于其他放疗组(P均<0.05),放疗+芍药苷高剂量组与放疗+芍药苷中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05),放疗+生理盐水组、放疗+地塞米松组、放疗+芍药苷低剂量组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

图1 正常组和放疗各组小鼠放疗前2 d和放疗后14 d内体重

2.3各组小鼠病理组织形态 正常组小鼠肠黏膜上皮和固有层腺体完整,腺体轮廓清晰、排列整齐,无明显炎症细胞浸润。放疗+芍药苷高剂量组小鼠在放疗后第4天出现肠绒毛局灶脱落,腺体结构完整、排列整齐;第6天肠绒毛损伤严重,出现肠绒毛变短,炎症细胞增多,腺体大小、深度不一,间质水肿;其他时间段损伤较轻。放疗+芍药苷中剂量组小鼠在放疗后第4天出现肠绒毛变短及脱落,第6天肠绒毛损伤严重,其他时间段损伤较轻。放疗+芍药苷低剂量组、放疗+生理盐水组及放疗+地塞米松组均在放疗后第2天即开始出现肠绒毛变短及脱落;第4天、第6天、第8天肠绒毛损伤严重,肠绒毛大片脱落,固有层腺体结构破坏,大小及颜色深浅不一,出现大量炎症细胞及间质颜色变浅,有水肿,第14天损伤较轻。见图2。

图2 正常组和放疗各组小鼠放疗后肠黏膜形态(HE染色,×10)

2.4各组小鼠生存情况 正常组及放疗后14 d内放疗+芍药苷高剂量组、放疗+芍药苷中剂量组小鼠均存活,总生存率为100%。放疗+芍药苷低剂量组在放疗后第4天、第5天、第6天、第7天、第10天各有1,1,1,2,1只小鼠死亡,存活4只,14 d总生存率为40%,中位生存时间为8.5 d。放疗+生理盐水组在放疗后第4天、第5天、第6天各有4,3,1只小鼠死亡,存活2只,14 d总生存率为20%,中位生存时间为5 d。放疗+地塞米松组在放疗后第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第11天各有1,1,3,1,2,1只小鼠死亡,存活1只,14 d总生存率为10%,中位生存时间为5.5 d。生存曲线差异有统计学意义(P均<0.05),见图3。

图3 正常组和放疗各组小鼠放疗后生存曲线

3 讨 论

炎症是组织损伤和细胞死亡的主要原因,炎症反应在电离辐射损伤中起着重要作用[6]。放射性肠炎是腹盆腔恶性肿瘤经放射治疗后引起的肠道放射性损伤,可导致肠黏膜及肠腺细胞的损伤,尤其是小肠,可表现为厌食、呕吐、腹泻、脱水、全身感染甚至败血性休克和死亡[7],不仅严重影响肿瘤患者的生活质量,也限制了放疗的最大剂量,影响总体治疗效果。

目前国内外对于放射性肠炎治疗的探索包括药物治疗、手术治疗、内镜下治疗等多种方法[8],其中药物预防或减轻辐射引起的损伤对于提高放疗治疗效果至关重要[9-10]。药物治疗包括抗炎药、抗氧化剂、硫酸铝、类固醇及其他类[11],我国专家共识1A类推荐洛哌丁胺治疗放射性肠炎的腹泻症状、类固醇激素灌肠治疗出血性肠炎,柳氮磺胺吡啶、巴柳氮、抗生素(甲硝唑、环丙沙星)、益生菌、生长抑素、短链脂肪酸灌肠等则作为1B类推荐药物[3]。但部分药物治疗效果有限,治标不治本,停药后症状可反复,因此寻找新的治疗方向迫在眉睫。

芍药苷对于炎症疾病的治疗具有很大潜力,其抗炎作用已经在各种炎性疾病的体外及动物体内实验中得到验证[12]。Ke等[13]报道芍药苷可以通过下调miR-29a、抑制NLRP3炎症小体通路激活缓解以腹泻为主的肠易激综合征小鼠的炎症反应,重建肠上皮屏障。Zhang等[14]发现芍药苷可以减轻葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎的严重程度。Gu等[15]研究表明芍药苷可以通过抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核因子-κB (NF-κB)信号通路和细胞凋亡对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎发挥保护作用。据此推测芍药苷对放射性肠炎也具有一定的治疗作用。

对于放射性肠炎动物模型放疗方式及剂量的选择,各个实验也存在差异。李宜放等[16]发现,大鼠在接受盆腔局部20 Gy照射后一般情况及直肠病理组织学变化与人类放射性直肠炎的表现相一致。王中秋等[17]采用瓦里安600CD直线加速器单次6 MV X射线10 Gy照射诱导小鼠放射性肠炎,照射后第2天小鼠开始逐渐出现腹泻或稀便,精神萎靡、懒动、体重减轻等,病理上表现为肠黏膜不完整,肠绒毛变短,隐窝和腺体正常结构消失,部分病灶表面上皮结构被破坏,可见明显的炎细胞浸润。本研究根据既往文献并结合前期预实验,选择18 Gy作为单次照射剂量,选取全腹部为照射部位,非照射部位用铅板遮住,模拟了临床放射性肠炎形成过程。

本研究发现,放疗+芍药苷高剂量组及放疗+芍药苷中剂量组小鼠在放疗后均未出现明显的消化道反应,小鼠精神及活动尚可,体重波动小;而放疗+生理盐水组小鼠在放疗后3 d即有半数小鼠出现解稀便及行动迟缓,且放疗+芍药苷低剂量组、放疗+生理盐水组、放疗+地塞米松组小鼠在放疗后体重下降明显,可能与进食少及肠道吸收障碍有关;肠组织HE染色显示,放疗+芍药苷低剂量组、放疗+生理盐水组、放疗+地塞米松组小鼠在放疗后较短时间内(2 d)即开始出现肠黏膜的损伤,而高剂量及中剂量芍药苷干预可以延长肠道组织损伤时限,减轻损伤程度,且未见明显治疗相关不良反应。表明较高剂量的芍药苷可以改善放疗后小鼠的一般状况,减轻消化道反应,保护肠道黏膜组织,缓解放射性肠炎导致的体重降低,且浓度越高效果越好。生存曲线分析显示,放疗+芍药苷低剂量组、放疗+生理盐水组、放疗+地塞米松组小鼠放疗后中位生存时间为8.5 d、5 d、5.5 d,而放疗+芍药苷高剂量组和及放疗+芍药苷中剂量组小鼠放疗后14 d内均存活,表明腹腔灌注芍药苷可以降低放射性肠炎小鼠病死率,且浓度越高效果越佳。

综上所述,18 Gy 10 MeV电子线全腹部单次照射可成功构建小鼠放射性肠炎模型;较高剂量芍药苷腹腔灌注可以保护放射性肠炎小鼠肠黏膜,缓解消化道反应和体重下降,提高小鼠生存率,且安全。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。