基于系统生物学和分子对接探讨益肾固胎颗粒治疗复发性流产的作用机制

钱艳平,陈 茁,詹兴秀,牛红萍,万茜茜,姜丽娟

(1. 云南省中医医院/云南中医药大学第一附属医院,云南 昆明 650021;2. 云南中医药大学,云南 昆明 650500)

根据最新的欧洲人类生殖与胚胎学会指南规定,与同一性伴侣发生连续2次或2次以上妊娠24周前的胎儿丢失,定义为复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)[1],中医称其为“滑胎”。RSA是一种严重的妊娠生殖障碍,其致病因素错综复杂,目前已知的病因主要与染色体、内分泌代谢、子宫解剖异常及感染、易栓症、全身性疾病、环境心理等因素有关,但仍有高达50%的病因未明确[2]。基于中医“肾为先天之本,藏精,主生长、发育与生殖。冲任之本在肾,胞络系于肾”的理论,认为肾气盛实,则任通冲盛,胎自安固,肾虚是导致滑胎的基本病机。RSA作为妇产科一种常见的妊娠并发症,是全世界关注的疑难杂症之一,发病率占生育期女性的1%～5%[3],而且随着流产次数的增加,RSA的复发风险也逐渐上升[4]。目前,西医针对RSA的治疗尚无确切有效的治疗方法,主要采用孕酮类药物、抗凝及免疫进行预防性治疗,在临床取得一定的疗效,但存在免疫排斥、感染、出血等风险[1,5]。中医治疗滑胎采用辨证与辨病相结合,以补肾健脾、调理冲任、巩固胎元为原则,在整体性的基础上强调治疗的个体化,临床收效显著,且对胎儿生长发育无不良影响[6]。但中医复方作用机制复杂,故需要借助系统生物学多维度预测“药物-靶点-疾病”之间的网络机制。

系统生物学主要研究基因调控网路、细胞信号传导、生物系统组成之间相互关系的结构和系统功能,体现系统论和实验计算方法整合研究的特征。网络药理学作为一种新兴药物的研究方法,通过系统生物学理论和方法,从整体网络角度分析药物有效成分与疾病之间的复杂关系及其相互作用机制[7]。益肾固胎颗粒(Yi Kidney Fertility Granules,YKFG)是云南中医药大学第一附属医院院内制剂,由菟丝子、黄芪、桑寄生、杜仲、川续断、淫羊藿、党参、白术、茯苓、阿胶和甘草组成。方中菟丝子、白术补肾健脾为君药;川续断、杜仲、淫羊藿、桑寄生温阳补肾,黄芪、党参、茯苓助白术健脾益气,共为臣药;佐阿胶以止血补血、滋阴养血;甘草调和诸药为使药。前期临床研究证实益肾固胎颗粒可明显缓解脾肾两虚型滑胎患者的临床症状,改善血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、β人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)水平,提高妊娠成功率,且未见明显不良反应及毒副作用[8]。关于益肾固胎颗粒的院内制剂研发,其急性毒性实验已由云南中医药大学第一附属医院中心实验室万春平博士完成,实验结果显示本品短期服用比较安全。益肾固胎颗粒多用于治疗先兆流产、复发性流产的患者,临床疗效显著。其所含有效成分及治疗靶点较多,无法明确具体的治疗靶标及作用机制。本研究基于系统生物学理论和方法,通过网络药理学数据分析及分子对接技术探讨益肾固胎颗粒治疗RSA的分子机制,为进一步的实验研究提供理论基础及科学依据,使传统中医药的临床经验研究向循证医学研究转变。

1 资料与方法

1.1益肾固胎颗粒活性成分和靶点的收集与筛选利用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM数据库检索益肾固胎颗粒(菟丝子、黄芪、桑寄生、杜仲、川续断、淫羊藿、党参、白术、茯苓、阿胶、甘草)的主要活性成分。设置口服生物利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18,以此为过滤条件作进一步筛选。根据药物有效成分的摩尔数,在相关靶标中搜索与药物有效成分对应的靶蛋白名称。BATMAN-TCM根据分数截止值为20,预测的候选目标(包括已知的目标)其得分不小于20,多次测试校正后设置P值的截止值(调整后的P值)小于0.05。将筛选到的活性成分通过Pub Chem数据库进行SMILES晶体结构查询,将不能查询到晶体结构的活性成分进行剔除。将获取靶点导入Uniprot数据库 (http：//www．uniprot．org/),设置基因来源为人源性,转换官方基因名,去除重复基因和数据库中未经验证的基因即为各个成分的潜在靶点。

1.2RSA靶点的预测 以GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)、OMIM数据库(https：//www.omim.org/)为平台,“Recurrent spontaneous abortion”为关键词进行搜索,取交集并删除重复靶点,获取RSA靶标。通过Draw Venn Diagram网站(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线分析,绘制药物-疾病靶点的韦恩图,获得其交集靶点。

1.3药物-活性成分-疾病-靶点网络(D-A-T网络)的构建 利用Cytoscape 3.8.2软件绘制药物-活性成分-疾病-靶点网络(D-A-T网络)。在此基础上,利用其内置工具网络分析仪计算益肾固胎颗粒的活性成分和靶点的网络拓扑参数,根据度值选择主要活性成分,构建D-A-T网络图以探究益肾固胎颗粒的药理学作用机制。

1.4基因本体论(GO)富集与京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析 通过DAVID(https：//david. ncifcrf. gov/)网站,借助“Functional Annotation Tool”对交集靶点进行GO富集分析,包括生物过程、细胞成分和分子功能3个模块的分析。以P<0.05和FDR<0.05为标准筛选,根据涉及靶点数目排序,选取前10位;同时对交集靶点进行KEGG通路分析,以P<0.01为筛选标准,根据KEGG通路分析结果及P值大小排序,选取前20位,分别建立通路与对应靶点之间的相互作用关系和节点属性与对应靶点之间的相互作用关系,并导入Cytoscape 3.7.2软件中,构建益肾固胎颗粒治疗RSA的“通路-靶点”关系网络图。

1.5益肾固胎颗粒蛋白相互作用网络关系构建(PPI网络构建)及关键基因筛选 为进一步说明靶点蛋白在系统水平上的作用,通过使用“多蛋白”作为数据分析模式,所需置信度(综合得分)>0.9作为阈值,通过STRING数据库(http：//www.string-db.org/)对共有靶点进行PPI分析,并将数据以tsv文件格式保存后,得到PPI网络图。将数据结果导入到Cytoscape 3.8.2中,使用CytoHubba插件获得益肾固胎颗粒的核心基因,按度值排序后,取前10名作为核心靶点。最后在PubMed中检索关键靶点作用于RSA的药理作用。

1.6分子对接验证 从TCMSP数据库下载D-A-T网络图中度数最高的20种活性成分及PPI网络中度数值最高的10种核心靶标的MOL2格式文件,从蛋白质数据库(http：//www.rcsb.org/pdb)获得关键蛋白的3D结构。运用AutoDockTools 1.5.6和PyMOL软件对关键靶点蛋白进行去除水分子,分离配体和受体,加入极性氢,计算Gasteiger电荷,分配AD4类型,将小分子配体柔性键设置为可旋转等操作。对接过程使用AutoDock Vina执行,最后将结合能最低的模型运用PyMOL软件进行可视化。

2 结 果

2.1益肾固胎颗粒有效成分筛选及靶点预测 通过TCMSP和BATMAN-TCM数据库检索,并查阅已发表的相关文献进行补充,最终收集到益肾固胎颗粒所包含的11味中药,共有161个有效活性成分,其中川续断11个,白术7个,阿胶3个,党参21个,杜仲15个,茯苓15个,甘草33个,黄芪20个,桑寄生2个,菟丝子10个,淫羊藿23个。剔除重复及非人类靶标基因后,Uniprot校正为官方名称,最终获得1 101个活性成分靶点。

2.2RSA靶点预测结果 利用Genecards数据库和OMIM数据库,以“Recurrent spontaneous abortion”为关键词进行搜索,分别获得了2 069个和90个RSA相关基因,合并所得疾病靶点,去除重复值后,最终得到2 146个疾病靶点。将1 101个药物靶点和2 146个疾病靶点通过Draw Venn Diagram网站在线分析,获得346个交集靶点,并绘制韦恩图(见图1)。

图1 益肾固胎颗粒与复发性流产相互作用靶点的韦恩图

2.3药物-活性成分-疾病-靶点网络(D-A-T网络)的构建 分别将益肾固胎颗粒的161个活性成分和346个药物-疾病共同靶点导入Cytoscape3.8.2软件,构建D-A-T网络图(见图2)。该网络包括11个药物节点、1个疾病节点、125个活性成分节点和346个靶蛋白节点。从网络分析仪中一共获得483个节点,2 323条边,平均度值为17.39。根据度值(见表1)筛选了前20个活性成分,它们可能是益肾固胎颗粒治疗RSA的核心成分(注：20种活性成分未找到相应的靶点,11种活性成分是某些中药常见的,因此网络图中仅显示了125种活性成分)。

表1 益肾固胎颗粒的主要活性成分

橙色节点是药物,蓝色节点是活性成分,绿色节点是交叉靶点;TSZ为菟丝子,HQ为黄芪,SJS为桑寄生,DZ为杜仲,CXD为续断,YYH为淫羊藿,DS为党参,BZ为白术,FL为茯苓,EJ为阿胶,GC为甘草

A. 生物过程直方图;B. 细胞成分直方图;C. 分子功能直方图;D. KEGG信号通路富集直方图

A. PPI网络;B. 关键靶蛋白网络的相互作用;C. 核心靶标条形图

2.4GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 利用DAVID数据库进行常见靶点的GO富集分析,包括生物过程、细胞组成和分子功能等3个模块的分析,以P<0.05和FDR<0.05为筛选条件,分别获得207个分子功能(Molecular Function,MF)、3 380个生物过程(Biological Process,BP)和153个细胞组成(Cellular Component,CC)。根据P值分别选择每个亚型中的前10个生物过程,并在图3的GO基因富集条中列出(图3A、图3B、图3C)。条形图的长度表示生物过程中目标位置的富集水平,条形图的颜色表示其调整后的P值,P值越小颜色越红。结果表明,益肾固胎颗粒治疗RSA的主要靶点的生物学过程主要集中在外部刺激、有机物含氧化合物等方面;细胞组成过程主要集中在细胞表面、膜微区、膜筏、膜区、神经元投射等;分子功能主要在受体结合、蛋白质二聚化活性、酶结合、信号转导等方面。

KEGG通路富集分析进一步解释了益肾固胎颗粒治疗RSA的潜在机制,通过DAVID数据库对346个共同靶基因进行KEGG富集分析,得到186条信号通路。设置P<0.01为筛选标准,根据P值大小进行排序,筛选出糖尿病并发症中的糖化终末产物及其受体信号通路(AGE-RAGE)、人巨细胞病毒感染(HCMV)、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白聚糖、TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路等前20个主要信号通路。这些通路可能是益肾固胎颗粒治疗RSA的关键途径(图3D)。

2.5PPI网络分析和核心靶基因筛选 利用STRING数据库,以“多蛋白”为数据分析模式,以置信度>0.9为阈值,将346个药物-疾病共同靶点导入Cytoscape3.8.2,并利用其中Cytohubba插件分析交集网络中各个节点的属性值,绘制PPI网络图(图4A)。按照Degree值进行筛选,取排名前10的靶点作为核心靶点,分别为酪氨酸蛋白激酶c(SRC)、雌激素受体基因1(ESR1)、1号染色体的原癌基因(JUN)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、骨肉瘤癌基因(FOS)、细胞肿瘤抗原(TP53)、上皮细胞生长因子受体(EGFR)、人β-连环蛋白(CTNNB1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8),并绘制条形图(图4C),其中水平坐标是Degree值,垂直坐标是每个蛋白基因符号的缩写。表明益肾固胎颗粒可能通过这些蛋白对RSA发挥治疗作用。

Degree值表示连接该节点的条数,节点代表潜在作用靶点,边代表靶点之间存在的相互作用关系。

节点的大小和颜色代表靶点的度值,节点越大、颜色越深,表明靶点在网络体系中的度值越大,参与的生物功能越多,其生物重要性越强;连线越多,说明关联度越大,代表的生物学意义越大。

2.6分子对接 将上述列表中的活性成分分子对接至核心靶点SRC(PDBID：1A09)、ESR1(PDBID：1A52)、JUN(PDBIB：1JNM)、MAPK1(PDBIM：1TVO)、FOS(PDBII：1S9K)、TP53(PDBID：1JSP)、EGFR(PDBIT：1XKK)、CTNNB1(PDBID=2Z6H)、AKT1(PDBID：1UNQ)、MAPK8(PDBID：3ELJ),并计算核心化合物与核心靶点之间的结合能以预测其结合活性。低于0的结合能表明这两个分子可以自发结合,结合能的负值越高表明结合活性越强。分子对接结果表明,核心组分和核心靶标大多能够良好结合(见表2)。此外,核心组分MOL0005002和核心靶标ESR1的结合能为-7.31 kcal/mol,这是对接结果中最小的结果,表明益肾固胎颗粒可能通过ESR1发挥对RSA的治疗作用。核心靶标和核心组分的对接结合能是使用PyMOL证明它们之间相互作用的最低模型。依据自由结合能的大小,选取部分对接结果进行可视化,利用PyMOL软件绘图(见图5)。由图可见,β-谷甾醇能稳定地对接到PIK3CA蛋白结构6GVF的活性口袋中,二者通过氨基酸残基LYS-271发生氢键作用;山柰酚能稳定地对接到AKT1蛋白结构1UNQ的活性口袋中,二者通过氨基酸残基AGR-48和ASN-54发生氢键作用;槲皮素能稳定地对接到MAPK1蛋白结构2Y9Q的活性口袋中,二者通过氨基酸残基GLU-33和LYS-114发生氢键作用。因此认为山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇等是益肾固胎颗粒中重要的潜在活性化合物。

表2 核心活性成分和核心靶标的分子对接结果

图5 分子对接模式图

3 讨 论

益肾固胎颗粒是姜丽娟教授治疗滑胎的临床常用方,该方由寿胎丸和四君子汤加减化裁而来。寿胎丸是中医安胎基础方,四君子汤为健脾益气常用方,两方合用辨证治疗滑胎,具有补肾固冲、健脾安胎的作用。药理研究证明：寿胎丸安胎机制主要为缓解平滑肌痉挛,抑制子宫收缩,提高孕期雌孕激素水平,改善盆腔内环境,调节神经体液内分泌功能,具有雌激素样作用,可促进胚胎发育[9]。白术醇对未孕子宫自发性收缩及对催产素引起的子宫兴奋均呈显著抑制作用[10]。研究表明,黄芪、党参、茯苓具有增强免疫、改善血流动力学、促进红细胞及血红蛋白生成等作用[11];阿胶具有耐缺氧、增强免疫、促进止血等作用[12]。上述诸药合用可达补肾健脾安胎之效,使胎系能固。

中药复方治疗疾病作用机制复杂,但关于中医药的疾病作用机制研究主要集中在单一的靶点或信号通路,且对中药有效成分的互作关系不明确,难以体现中医治病的整体性和系统性。本研究基于系统生物学理论和方法,通过网络药理学和分子对接技术,对益肾固胎颗粒治疗RSA的机制做系统探讨。对益肾固胎颗粒所含的11味中药的有效成分进行筛选,得到与RSA相关的2146个疾病靶点,1 101个药物靶点。通过数据分析显示主要有效成分是槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(luteolin)、异鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)等,大都属于黄酮类化合物。槲皮素共存于黄芪、菟丝子、桑寄生、淫羊藿中,可通过JAK2/STAT3通路促进先兆流产大鼠卵巢、子宫合重增加,脏器系数升高,降低流产率及胚胎吸收率[13];降低LPS诱导的模型小鼠早产发生率,并通过NF-κB/AP-1通路增加后代存活率[14]。淫羊藿、黄芪、菟丝子、杜仲四味中药均含有山柰酚,通过体外细胞实验发现山柰酚可显著抑制苯并芘(BaP)引起的人绒毛膜外滋养层细胞HTR8/SVneo的凋亡率[15];还能改变衰老卵母细胞中的氧化应激、过氧化物酶体、TNF信号传导、cAMP信号传导和间隙连接途径,改善老化卵母细胞的不良妊娠结局[16]。此外,木犀草素可促进正常怀孕大鼠子宫动脉等血管平滑肌的松弛,对先兆子痫具有保护作用[17]。异鼠李素可抑制炎症相关因子及通路发挥抗炎作用[18];Liu等[19]研究发现,母体血清Th1细胞因子与血清植物甾醇水平呈正相关,植物甾醇(特别是β-谷甾醇)可通过诱导孕妇的Th1分泌来调节Th1/Th2平衡。可见益肾固胎颗粒主要通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、异鼠李素等成分作用于RSA患者,体现作用机制的多靶点和多途径等特点。

对本研究筛选所得的346个交集靶点通过PPI网络分析以及生物过程GO分析,发现益肾固胎颗粒治疗复发性流产的主要核心靶点是SRC、ESR1、JUN、MAPK1、FOS、TP53、EGFR、CTNNB1、AKT1和MAPK8。根据分子对接结果显示,槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、异鼠李素与这些核心靶点亲和力好,为网络药理学研究益肾固胎颗粒治疗RSA提供了可靠保证。研究证明,通过HIF-1α/SRC/LDHA通路,可促使滋养层来源的乳酸(LA)在蜕膜巨噬细胞介导的复发性流产中起至关重要的作用[20];对已婚夫妇的检查揭示ESR1基因的多态性变异A-351G与特发性不孕症(遗传的对数加性模型)和早期胚胎丢失(过度显性遗传模型)的风险增加密切相关[21];此外,MAPK1的磷酸化水平在先兆子痫胎盘中显著降低[22];VEGFA、NOS1和CTNNB1失调引起子宫血管高通透性可诱发子宫血管微环境中的自噬缺陷,导致先兆子痫的发生[23];自然流产的蜕膜组织中EGFR-1表达较高,表明EGFR-1可促进绒毛外滋养层的破坏性入侵[24];TP53可促进胎盘滋养层细胞凋亡,诱发流产[25]。这些说明SRC、ESR1、MAPK1、EGFR、CTNNB1、MAPK8 TP53等靶点与流产等妊娠相关疾病有关。

KEGG通路富集分析显示,益肾固胎颗粒对RSA的治疗主要通过AGE-RAGE、PI3K-Akt、TNF、MAPK、IL-17等信号通路发挥作用。研究结果证实,调控AGEs-RAGE信号通路可对妊娠糖尿病大鼠胎儿发育起保护作用[26];PCOS小鼠的胚胎丢失率可通过激活AMPK/PI3K/Akt/FoxO3a信号通路,改善滋养层凋亡来预防[27];在妊娠早期监测IL-17A,可作为流产风险评估的生物标志物[28];在不明原因复发性流产(URSA)患者的绒毛中,RASA1基因启动子中H3K27me3的富集减少,RASA1基因异常激活,RASA1基因的异常激活可导致Ras-MAPK通路的异常失活,进而抑制滋养层细胞的增殖和侵袭能力,可见RASA1-Ras-MAPK调节轴的异常与URSA的发展密切相关[29];若TNF-α失调导致免疫调节失衡,将引起Th1/Th2细胞平衡紊乱,扰乱母胎界面,导致复发性流产[30]。

本研究从网络药理学及分子对接层面对益肾固胎颗粒进行系统探究,进一步阐明其治疗RSA的潜在作用机制。结果表明益肾固胎颗粒主要通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、异鼠李素等多种有效成分作用于SRC、ESR1、JUN、MAPK1、FOS、TP53、EGFR、CTNNB1、AKT1和MAPK8等基因靶点,调控AGE-RAGE信号通路、HCMV、PI3K-Akt信号通路、癌症中的蛋白聚糖、TNF信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路等20个信号通路发挥治疗RSA的作用。可见,益肾固胎颗粒主要从母胎免疫界面、炎症反应、胎盘滋养层细胞代谢、宫腔内环境等方面治疗RSA。为进一步深入研究奠定基础,为临床治疗RSA的组方用药提供一定的参考价值。结合本研究数据,查阅大量文献后发现,中医复方治疗疾病作用机制复杂,药味的加减即可对全方的中药活性成分及作用靶点产生巨大影响。这也提示我们在科研设计及临床观察研究中,中药组方的固定对于确切的分子机制研究至关重要。此外,本研究过程未涉及益肾固胎颗粒的剂量配比、服药剂型及煎煮方法等,故仍待进一步的动物实验或细胞实验研究来验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。