白藜芦醇通过MCU抑制mPTP开放减轻H9c2细胞氧化应激损伤

刘天宇 张欣宇 郭佳宝 王培 贺永贵 习瑾昆, 郑桓

(华北理工大学 1基础医学院 河北省慢性疾病基础医学重点实验室,河北 唐山 063210;2公共卫生学院;3临床医学院)

氧化应激是导致心肌细胞死亡的重要原因,是缺血性心脏病发生的重要环节,可以引发动脉粥样硬化、心肌缺血/再灌注损伤等。因此,减轻心肌细胞氧化应激损伤是心肌保护的重要策略之一〔1〕。 白藜芦醇(resveratrol)属于非黄酮多酚类化合物,从最初“法国悖论”开始,白藜芦醇的生物学效应得到广泛关注,其中最重要的就是心脑血管保护作用〔2〕。白藜芦醇通过诱导药物性预处理和后处理机制保护缺血/再灌注心脏,氧化应激、内质网应激、凋亡、自噬、一氧化氮等参与其心肌保护作用〔3,4〕。本实验室早期研究也证实,白藜芦醇通过环磷酸鸟苷(cGMP)/环尿苷酸依赖性蛋白激酶(PKG)信号使糖原合成酶激酶(GSK)-3β失活,通过与线粒体靶向素环蛋白(Cyp)D结合阻止线粒体通透性转移孔(mPTP)的开放,从而保护再灌注心脏〔5〕。

线粒体膜上存在的mPTP在心肌缺血/再灌注损伤中起关键作用。mPTP在再灌注早期开放并导致心肌细胞损伤,阻止再灌注时mPTP开放,可以减轻缺血/再灌注损伤,因此也被称为最终效应器〔6〕。研究显示,心肌梗死与重塑的病理基础是心肌细胞死亡,包括自噬、线粒体死亡途径、凋亡、坏死、焦亡和铁死亡,其中mPTP开放引起线粒体死亡途径与心肌损伤关系密切〔7〕。因此,阻止mPTP开放是有效保护心肌细胞的关键。白藜芦醇预处理可以减轻Ca2+超载,进而阻止mPTP开放。本实验室研究显示,Res通过增加细胞内锌离子(Zn2+)阻止mPTP开放,减轻缺氧/复氧损伤,保护内质网应激(ERS)的心肌细胞〔3,5〕。内质网是细胞内Zn2+的贮藏所,外界因素刺激能够促进Zn2+从内质网中释放,与此同时,Zn2+同样能够维持内质网正常功能〔7〕。

本实验室最新研究证实,Zn2+通过线粒体钙离子单向转运蛋白(MCU)影响细胞内钙离子(Ca2+)和活性氧(ROS)进而阻止mPTP的开放,保护H9c2心肌细胞〔8～10〕。然而,白藜芦醇是否通过MCU抑制mPTP开放及其机制尚不得而知。本研究利用大鼠H9c2心肌细胞,用过氧化氢(H2O2)建立氧化应激模型,探究Res是否通过MCU阻止mPTP开放从而发挥心肌细胞保护作用,并探讨可能的信号转导机制。

1 资料与方法

1.1主要仪器与试剂 白藜芦醇(美国Sigma公司,批号:038K5202);四甲基罗丹明乙酯(TMRE)红色荧光染料(美国Molecular Probes公司,批号:T669);Fluo-4AM 荧光染料(Thermo Fisher Scientific公司,批号:F14201);葡萄糖调节蛋白(GRP)78、GRP94、MCU mAb,β-tubulin mAb,Anti-rabbit IgG辣根过氧化物酶(HRP)-linked Antibody等抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司;Opti-MEM培养基(美国Gibco公司),MCU siRNA(中实基因科技有限公司),LipofectamineTM3000(美国Invitrogen公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒、电化学发光(ECL)试剂盒、ROS试剂盒〔2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光染料〕、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)快速配制试剂盒均购自碧云天生物技术研究所;钌红(Sigma-Aldrich公司,批号:00541-1G)。CO2孵育箱(Forma公司产品);CKX31倒置相差显微镜;FV 1000激光扫描共聚焦显微镜(日本OLYMPUS公司);高速冷冻离心机(德国IKA公司)。

1.2细胞培养 大鼠胚胎心脏组织来源H9c2细胞株(美国标准菌种收藏中心,ATCC),用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM培养基,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。2～3 d换液,细胞融合达85%时,以0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸(EDTA)消化传代。

1.3实验分组 实验随机分为4组:①对照组:心肌细胞常规培养。②H2O2组:200 μmol/L H2O2孵育20 min。③白藜芦醇+H2O2组:100 μmol/L白藜芦醇、200 μmol/L H2O2各孵育20 min。④钌红+白藜芦醇+H2O2组:20 μmol/L钌红孵育30 min、100 μmol/L白藜芦醇、200 μmol/L H2O2各孵育20 min。

1.4乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤程度 细胞根据实验分组进行给药预处理,吸取上清液,1 000 r/min离心5 min。根据LDH试剂盒说明书向空白孔、标准孔、对照孔、测定孔中加入各类试剂及离心后的上清液。混匀,37 ℃孵育15 min,将每孔加入2,4-二硝基苯肼0.025 ml,混匀,37 ℃孵育15 min,各孔加入0.4 mol/L氢氧化钠溶液0.25 ml,混匀,室温放置5 min。在酶标仪450 nm处测定各孔的吸光度值,绘制标准曲线,根据公式进行计算。

1.5Western印迹检测GRP78、GRP94、MCU蛋白的表达 细胞生长至90%融合状态,根据实验分组处理细胞。生理盐水冲洗3次后每组加入50 μl新鲜配制的细胞裂解液,冰上裂解30 min。收集裂解液,超声波处理器进一步破碎,于12 000 r/min(-4 ℃),离心15 min。取上清,BCA测定蛋白浓度,按照酶标仪测定结果进行蛋白分装,将蛋白煮沸后上样、电泳、转膜。10%脱脂牛奶室温封闭60 min,GRP78、GRP94、MCU、β-tubulin等抗体(1∶1 000稀释),4 ℃孵育过夜。二抗(1∶2 000稀释)室温孵育2 h,ECL荧光显色。ImageJ软件对图像进行灰度分析并统计。

1.6MCU siRNA转染 首先进行MCU沉默RNA的筛选。3种MCU siRNA序列号分别为374、761、984。按序列号分组,将阴性siRNA(NC组)作为参考,Western印迹检测3种MCU siRNA(分别为MCU374、MCU761及MCU984组)沉默效率。细胞接种于6孔板中(8×104个/孔),密度约50%时进行转染,将6孔板中的培养基弃去,加入1 800 μl Opti-MEM培养基。分别用92.5 μl Opti-MEM培养基稀释7.5 μl NC siRNA、7.5 μl MCU siRNA、7.5 μl LipofectamineTM3000并混匀,将上述稀释的 LipofectamineTM3000分别加入稀释的NC siRNA和MCU siRNA混合轻轻振荡并室温孵育20 min,于6孔板中置于37 ℃、5% CO2条件下培养48～72 h进行后续实验。采用Western印迹检测白藜芦醇对MCU蛋白表达的影响,分组为阴性siRNA为NC siRNA Con组、加H2O2阴性为NC siRNA H2O2组、加白藜芦醇和H2O2阴性为NC siRNA Res+H2O2组、加MCU siRNA的白藜芦醇和H2O2为MCU siRNA Res+H2O2组。

1.7激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+、ROS、mPTP 细胞培养于共聚焦专用小皿内,密度适合生长状态良好时,将皿中培养基弃去,生理盐水洗涤3次,将稀释好的染料均匀加入共聚焦小皿,于37 ℃下培养20～30 min,生理盐水洗涤3次,加入2 ml空白培养基,选取合适的视野,通过激光扫描共聚焦显微镜检测荧光强度。细胞内Ca2+用Fluo-4 AM荧光探针测定;细胞内ROS用DCFH-DA荧光探针测定;线粒体膜电位用TMRE荧光探针测定进而了解mPTP的开放程度。

1.8统计学分析 采用SPSS26.0及GraphPad Prism8软件分析,完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组均值的组间差异比较。

2 结 果

2.1白藜芦醇抑制氧化应激引起的ERS 与对照组相比,H2O2使GRP78和GRP94蛋白表达明显增加,白藜芦醇明显抑制此作用,钌红明显加强了白藜芦醇的作用(P<0.05),说明白藜芦醇可能通过MCU抑制氧化应激引起ERS。见图1、表1。

1～4:对照组、H2O2组、白藜芦醇+H2O2组、钌红+白藜芦醇+过氧化氢组

2.2白藜芦醇通过MCU抑制氧化应激 与对照组相比,H2O2处理后的心肌细胞LDH漏出明显增加,白藜芦醇明显减少H2O2诱导的LDH增多,而钌红明显加强了白藜芦醇的作用(P<0.05),说明氧化应激诱导心肌细胞损伤,白藜芦醇可能通过MCU抑制氧化应激诱导的心肌细胞损伤。见表1。

2.3白藜芦醇对MCU蛋白表达的影响 与NC组(1.00±0.06)比较,MCU374、MCU761及MCU984组MCU siRNA活性(0.81±0.05、0.48±0.08、0.61±0.04)显著降低(F=42.39,P<0.05),说明3种MCU siRNA均可沉默MCU,其中MCU761沉默效率>50%,故后续实验采用MCU siRNA 761。与对照组相比,H2O2使MCU蛋白表达明显增加,白藜芦醇明显抑制了H2O2的作用,而钌红明显加强了白藜芦醇的作用(P<0.05)。说明白藜芦醇通过MCU抑制H2O2诱导的氧化应激。与NC siRNA Con组(1.00±0.02)比较,NC siRNA H2O2组MCU 蛋白表达(2.05±0.17)显著增高(P<0.05)。与NC siRNA H2O2组比较,NC siRNA Res+H2O2组MCU 蛋白表达(1.44±0.21)显著降低(P<0.05)。与NC siRNA Res+H2O2组比较,MCU siRNA Res+H2O2组MCU 蛋白表达(0.80±0.11)显著降低(P<0.05)。以上结果证实白藜芦醇通过MCU抑制H2O2诱导的氧化应激。见图1、表1、图2、图3。

2.4白藜芦醇对细胞内Ca2+的影响 与对照组相比,过氧化氢使Fluo-4AM绿色荧光强度显著增强(P<0.05),说明氧化应激使细胞内Ca2+增多,白藜芦醇明显抑制了过氧化氢引起的荧光强度增强,而钌红明显加强了白藜芦醇的作用(P<0.05),说明白藜芦醇通过MCU抑制过氧化氢诱导的细胞内Ca2+超载。见表1、图4。

2.5白藜芦醇对细胞内ROS的影响 与对照组相比,H2O2使H9c2心肌细胞中DCFH-DA绿色荧光强度显著增强,白藜芦醇明显抑制H2O2引起的荧光强度增强,而钌红则明显增强了白藜芦醇的作用(P<0.05),说明白藜芦醇通过MCU抑制H2O2诱导的细胞内ROS增多。见表1、图4。

2.6白藜芦醇对线粒体膜电位(mPTP开放)的影响 与对照组相比,H2O2使线粒体TMRE红色荧光强度显著降低,白藜芦醇明显抑制了TMRE荧光强度的降低,而钌红明显增强了白藜芦醇的作用(P<0.05),说明白藜芦醇通过MCU抑制H2O2诱导的mPTP开放。见表1、图5。

表1 各组GRP78、GRP94、LDH、MCU蛋白表达及Fluo4-AM、DCF、线粒体膜电位(mPTP开放)的影响

图2 Western印迹检测MCU siRNA表达

1～4:NC siRNA Con组、NC siRNA H2O2组、NC siRNA Res+H2O2组、MCU siRNA Res+H2O2组

图4 激光扫描共聚焦显微镜检测白藜芦醇对细胞内Ca2+及ROS的影响(×500)

图5 激光扫描共聚焦显微镜检测白藜芦醇对线粒体膜电位(mPTP开放)的影响(×500)

3 讨 论

心血管病是国内致死或致残的主要原因之一,且近年来,随着社会生活水平的不断发展,冠心病的发病率也随之升高,防治心血管疾病刻不容缓〔11〕。心血管病的发病机制包括氧化应激、线粒体损伤、凋亡、自噬、Ca2+超载等,其中氧化应激损伤是致病的主要因素。

白藜芦醇是从植物中提取的多酚类化合物,也是植物体在恶劣环境或遇到病毒侵害时分泌的一种抗毒素,可从不同植物品种中获得,其中葡萄、虎杖、花生等药用植物中的含量较高。研究表明,白藜芦醇可以保护H9c2心肌细胞免受缺氧/复氧损伤,可能与激活PTEN诱导激酶(PINK)1/Parkin信号通路促进线粒体自噬有关〔12〕。也有研究证明,白藜芦醇通过血红素加氧酶1的上调作用降低MiR-136-5p的表达,并对百草枯诱导的PC12细胞发挥神经保护作用〔13〕。课题组前期研究证实,白藜芦醇通过增加细胞内的锌离子进而抑制mPTP开放保护心肌细胞,进一步研究证实,锌离子通过线粒体MCU阻止mPTP开放,发挥H9c2心肌细胞保护作用。氧化应激是心肌细胞死亡的重要原因,白藜芦醇是否通过mPTP和MCU减轻心肌细胞氧化应激损伤尚不得而知。

内质网是心肌细胞重要细胞器,主要参与细胞内蛋白质合成、钙稳态和凋亡的调节。当内质网出现功能紊乱和应激的时候,会诱发蛋白错误折叠,缺血缺氧、氧化应激等内在应激刺激,可诱发内质网折叠蛋白质过程紊乱,即ERS。MCU位于线粒体内膜并负责线粒体内Ca2+的转运,通过MCU摄取的Ca2+失调会导致细胞功能紊乱,最终细胞凋亡。线粒体Ca2+的摄取需要MCU复合物共同完成,MCU复合物包括MCU及调节亚基(MICU、MCUb、EMRE)〔14〕。线粒体是细胞产生三磷酸腺苷(ATP)的场所,其参与体内多种代谢和信号调节,线粒体受损可引发细胞或器官损伤,线粒体完整性在减轻心肌细胞损伤中起着关键作用,是心肌细胞正常存活的关键调节点。有文献表明,中等浓度的H2O2后处理显著激活线粒体信号转导及转录激活蛋白(STAT)3,并抑制MCU减轻缺血再灌注诱导的心室肌细胞钙超载和收缩抑制〔15〕。此外,MCU在缺血再灌注期间过度开放,并通过MCU-Ca2+超载-mPTP开放的机制参与心肌再灌注损伤〔16〕。由此,本文推测,白藜芦醇可能通过MCU抑制mPTP开放,发挥心肌细胞保护作用。LDH是临床诊疗中常见的心肌损伤评估指标之一,也是诊断心肌梗死的常用指标。LDH有5个同工酶,其中心脏或心肌细胞中的含量较多,当细胞因外界因素受损时,心肌细胞中的LDH由于膜通透性改变释放到细胞外液中,LDH含量与心肌细胞受损程度呈正相关。本文提示,白藜芦醇可能通过MCU抑制H2O2诱导的心肌细胞损伤,发挥心肌细胞保护作用。

Ca2+是细胞内重要的第二信使,在细胞正常代谢中发挥重要作用。Ca2+超载导致ROS类物质过度生成,mPTP开放,线粒体裂变过度,最终导致细胞凋亡〔17〕。MCU是线粒体膜上的Ca2+通道蛋白,白藜芦醇抑制过氧化氢引起的MCU增加,白藜芦醇可能影响细胞Ca2+代谢。本研究说明,氧化应激使细胞内Ca2+超载,白藜芦醇通过MCU抑制氧化应激诱导的细胞内Ca2+超载。细胞中ROS的增多破坏抗氧化防御的相对平衡状态,从而引发细胞氧化应激反应,最终加速心肌细胞凋亡。同时,ROS导致Ca2+稳态破坏,线粒体内Ca2+超载,并介导mPTP开放〔18〕。由此可见,ROS大量生成和细胞内Ca2+浓度相关。本研究结果说明,氧化应激使细胞内ROS增多,白藜芦醇通过MCU抑制H2O2诱导的细胞内ROS增多。

线粒体通过氧化磷酸化产生ATP,是能量代谢、信号转导的重要细胞器,在心脏疾病的发病机制中发挥重要作用,是心肌损伤后心肌细胞命运的决定因素。ROS的过度产生、细胞Ca2+超载等引发mPTP开放,使线粒体膜电位下降,线粒体ATP产生障碍并启动细胞死亡途径,因此,mPTP是心肌保护重要靶点。本课题组先前研究证明,白藜芦醇通过细胞外调节蛋白激酶(ERK)/糖原合成酶激酶(GSK)-3β通路增加细胞内Zn2+阻止mPTP开放,保护H9c2心肌细胞,进一步研究显示,Zn2+通过MCU阻止mPTP的开放。本文结果提示,白藜芦醇通过MCU抑制H2O2诱导的mPTP开放,保护H9c2心肌细胞。