LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p调控 ITGA6表达对非小细胞肺癌增殖与迁移的影响

姜丹丹 罗喜钢

(1锦州医科大学,辽宁 锦州 121001;2锦州医科大学附属第三医院检验科)

近年来,高发病率及高致死率的肺癌成为众多研究学者的研究热点之一。依据组织形态学特性,肺癌被分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC),而NSCLC的发病率在80%～85%。由于疾病缺乏实时监测手段,大多数患者依靠手术切除与放化疗相结合的干预方案来缓解症状,极易影响患者的生活和生存质量〔1〕。因此,更进一步阐明NSCLC细胞的增殖与转移的分子机制,推动个体化靶向治疗的开展,具有重大临床意义。大量证据显示〔2〕长链非编码RNA(LncRNAs)及微小RNA(miRNAs)通过与靶基因、蛋白的相互作用参与肿瘤细胞的增殖、分化、转移与侵袭等过程。LncRNAs及miRNAs表达的异常直接影响肿瘤的发生、发展及恶性转移、化学耐药等进展。LncRNA MIR503HG位于人类基因组X染色体的134543377～134546630区域,是miR-503的宿主基因。Hu等〔3〕研究显示LncRNA MIR503HG在宫颈癌组织中的表达升高,并且高表达的LncRNA MIR503HG直接增强了癌细胞的体外增殖与侵袭能力。miR-32-5p位于人染色体9q31.3上,该区段的基因主要在基因扩增及蛋白修饰方面发挥作用。Yang等〔4〕研究显示miR-32-5p的表达在三阴性乳腺癌中明显降低,转染miR-32-5p mimic之后,细胞中波形蛋白(Vimentin)表达明显降低,E-钙黏蛋白(cadherin)表达明显升高,细胞的生长明显受限,诱导其趋于凋亡。但是有关LncRNA MIR503HG和miR-32-5p在NSCLC作用的报道较少。Li等〔5〕研究显示整合素α(ITGA)6在肺腺癌细胞的淋巴转移中发挥关键作用,是治疗肺腺癌淋巴转移最具潜力的治疗靶点,但是并未详细阐明ITGA6对肿瘤细胞的作用机制。本研究主要探讨LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6在NSCLC中的表达及其对NSCLC细胞增殖与转移的影响。

1 材料和方法

1.1在线分析信息〔6〕从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中提取273例NSCLC患者癌组织及其对应癌旁组织的LncRNA、miRNA及转录组mRNA的芯片数据,R软件中MAX STAT 函数包统计分析LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6在NSCLC中的表达情况。并通过GEPIA分析LncRNA MIR503HG、ITGA6对NSCLC患者预后的影响,通过UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析miR-32-5p对NSCLC患者预后的影响。

1.2NSCLC组织临床样本信息 选取2018年2月至2021年8月锦州医科大学附属第三医院手术切除的80例NSCLC患者的癌组织,平均年龄(47.65±18.93)岁,所有入选患者经病理切片确诊为NSCLC,均为原发性肺癌,并未经放化疗干预,入选患者的其他器官或组织未罹患恶性肿瘤、免疫缺陷等疾病,患者的病理资料均完整,同时收集远离病灶位置2 cm以上的癌旁组织。入选患者均已签署知情同意书,并且本研究经医院伦理委员审核批准。所有样本4%多聚甲醛常规固定,用于聚合酶链反应(PCR)检测。

1.3实验材料 人永生化支气管上皮细胞系BEAS-2B、NSCLC细胞系A549,PC9,H1975,H460,SK-MES-1,H1299购自广州赛库生物科技有限公司(中国广州)。LncRNA MIR503HG-mimic和LncRNA MIR503HG-mimic-NC,miR-32-5p-agomir和miR-32-5p-agomir-NC及pcDNA3.1-ITGA6由华强基因编辑技术(沈阳)有限公司提供。实验动物品系:BALB/c雄性裸鼠;清洁级别:SPF级;周龄:6～8周龄;体质量(20±2)g,50只,购自锦州医科大学,动物生产许可证号:SCXK(辽)2019-0003;实验动物适应性喂养1 w后开展实验,本研究已获取锦州医科大学附属第三医院伦理委员会的批准。实验试剂:兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体、Vimentin、E-cadherin及ITGA6抗体(美国Thermo公司),逆转录试剂盒、扩增试剂盒、RNA提取试剂盒购自(日本TaKaRa公司),灭活的胎牛血清(FBS)、多聚甲醛(江苏万邦医药集团有限公司),细胞裂解液、胰酶消化液、中性树脂(天津凯信化学工业有限公司),化学发光试剂、荧光剂Luciferin、磷酸盐缓冲液(PBS,江苏恩莫阿赛生物技术科技公司),Western印迹试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(天津利安隆博华生物技术有限公司),Transwell小室、双荧光素酶试剂盒、杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)培养基、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EDU)增殖试剂盒(成都科龙生物技术有限公司)。

实验仪器:组织研磨器(杭州奥盛科技有限公司),恒温培养箱(宁波新芝生物仪器有限公司),琼脂糖电泳仪及全自动凝胶成像分析系统(天能科技有限公司),CFX96荧光定量反转录(qRT-PCR)扩增仪(美国Bio-Rad公司),微量注射器(丹麦 Labogene 公司),光学显微镜(日本Olympus公司)

1.4qRT-PCR实验 Trizol法分别提取临床癌组织和细胞系的总RNA,在确定完整性和浓度后〔7〕,按逆转录试剂盒要求合成cDNA,PCR仪扩增目的基因。通过2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。基因序列为(5′-3′):LncRNA MIR503HGG上游引物:GTGACAGATGGGCTCTGCTT,下游:AAGGGCCAGTAG-TTGGAAGT;miR-32-5p上游引物:AGCTGCCCACTTGGTGAACGC,下游:TCAGGCCCGGAACAGTTGTGA;ITGA6上游引物:CCACCCCAAATACAAGACGGA,下游:CAGGTCTTCGCTAGGGTTGT;GAPDH上游引物:TGAAGGTCGGAGTCAACGG,下游:CCTGGAAGATGGTGATGGG。

1.5双荧光素酶实验 生物信息数据库预测LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6之间的作用位点,之后按照双荧光素酶试剂盒要求构建野生型与突变型质粒,依次与H1299细胞进行共转染,37 ℃,5%CO2条件下培养48 h后,检测酶活性。

1.6细胞的分组处理 取对数生长期的H1299细胞进行实验,分组转染操作如下:LncRNA-mimic-NC组细胞转染LncRNA MIR503HG-mimic-NC,常规培养;LncRNA-mimic组细胞转染LncRNA MIR503HG-mimic,常规培养;agomir-NC组细胞常温下转染miR-32-5p-agomir-NC,常规培养;agomir组细胞常温下转染miR-32-5p-agomir,常规培养;Lnc-mimic+agomir组细胞转染LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir,常规培养;Lnc-mimic+agomir+pc组细胞转染LncRNA MIR503HG-mimic+miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6,常规培养;agomir+pc组细胞常温下转染miR-32-5p-agomir+pcDNA3.1-ITGA6,常规培养;另取不进行任何转染的细胞常规培养作为Normal组。

1.7EDU染色实验 调整对数生长期的H1299细胞的浓度至1×105个/孔并接种在24孔板上,分组同1.6,空气湿度95%,5%CO2,37 ℃条件下培养24 h,收集各组细胞,PBS漂洗3次,每次3 min,每孔加入100 μl的EDU染色液,避光孵育,荧光显微镜观察,ImageJ软件进行统计分析。

1.8Transwell小室实验 各组细胞分组同1.6,将H1299细胞以1×106个/ml接种在已预先铺好基质胶的Transwell小室上室中,培养24 h,室温下,结晶紫避光染色,孵育30 min,镜检。

1.9裸鼠皮下种植NSCLC实验 将50只实验动物按随机数字表法分为5组:Normal组、LncRNA-mimic-NC组、LncRNA-mimic组、mimic+agomir组、mimic+agomir+pc组,每组10只。各组细胞分组处理同1.6,常规培养24 h,重悬细胞,将各组细胞分别注射至对应组的裸鼠体内,同时腹腔注射荧光剂,无菌操作台上,显微镜下,连接活体小动物成像系统(VIS)。常规喂养裸鼠4 w后,断头处死,取出各组动物皮下组织中的肿瘤块,待测。

1.10Western印迹实验 放射免疫沉淀试验(RIPA)法裂解细胞,离心后,BCA法测定上清液中的蛋白浓度,以50 μg进行电泳分离,湿法转膜后,封闭,加入一抗(ITGA6、Vimentin、E-cadherin、GAPDH的稀释比例均为1∶500),4 ℃避光孵育24 h,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗,加入二抗(1∶1 500),孵育,ImageJ软件统计分析〔8〕各条带灰度值。

1.11统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验及Spearman相关分析,制图采用软件Graphpad8.1。

2 结 果

2.1临床肿瘤组织中LncRNA MIR503HG和miR-32-5p表达 与癌旁组织相比,NSCLC肿瘤组织中LncRNA MIR503HG、ITGA6 mRNA水平明显增加,miR-32-5p mRNA水平明显下降(均P<0.05);经GEPIA数据库分析显示,与LncRNA MIR503HG高表达的NSCLC患者相比,LncRNA MIR503HG低表达患者的生存曲线明显升高(P<0.05);经UALCAN数据库分析,与miR-32-5p高表达的NSCLC患者相比,miR-32-5p低表达患者的生存曲线明显降低(P<0.05);Spearman相关性分析结果显示,LncRNA MIR503HG与miR-32-5p在NSCLC癌组织组织中的表达呈明显负相关(P=0.000)。见图1、表1。

图1 在线分析LncRNA MIR503HG和miR-32-5p对NSCLC患者生存期的影响及二者表达的相关性

2.2NSCLC肺癌细胞系中LncRNA MIR503HG、miR-32-5p及ITGA6 mRNA表达 与BEAS-2B细胞相比,LncRNA MIR503HG、ITGA6 mRNA在NSCLC细胞系A549,PC9,H1975,H460,SK-MES-1,H1299中表达水平明显增加,miR-32-5p mRNA表达水平明显下降(均P<0.05),而H1299细胞中LncRNA MIR503HG、miR-32-5p、ITGA6 mRNA表达与BEAS-2B细胞中差异最明显,后续细胞实验均使用H1299细胞。见表1。

表1 临床样本及细胞系中LncRNA MIR503HG、miR-32-5p和ITGA6 mRNA相对表达比较

2.3双荧光素酶实验 ENCORI数据库显示LncRNA MIR503HG和miR-32-5p存在互补位点,见图2。双荧光素酶实验结果显示,以LncRNA MIR503HG mimic过表达LncRNA MIR503HG后,miR-32-5p(野生型)荧光素酶活性明显下降(P<0.05),miR-32-5p(突变型)荧光素酶活性无明显差异(P>0.05),说明在NSCLC中,LncRNA MIR503HG可靶向调控miR-32-5p表达。见表2。

图2 LncRNA MIR503HG与miR-32-5p的特异性结合位点

表2 双荧光素酶结果

2.4LncRNA MIR503HG通过miR-32-5p表达影响H1299细胞体外增殖与迁移能力 EDU染色实验结果显示,与Normal组相比,LncRNA-mimic组、Lnc-mimic+agomir组能明显升高EDU阳性细胞比例(P<0.05);与LncRNA-mimic组相比,Lnc-mimic+agomir组EDU阳性细胞比例明显降低(P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,与Normal组相比,LncRNA-mimic组、Lnc-mimic+agomir组迁移细胞数量明显升高(P<0.05);与LncRNA-mimic组相比,Lnc-mimic+agomir组迁移细胞数量明显降低(P<0.05)。Western印迹实验结果显示,与Normal组相比,LncRNA-mimic组、Lnc-mimic+agomir组ITGA6、Vimentin表达水平明显升高,E-cadherin表达水平明显降低(P<0.05);与LncRNA-mimic组相比,Lnc-mimic+agomir组ITGA6、Vimentin表达水平明显降低,E-cadherin表达水平明显升高(P<0.05)。见图3、表3、图4。

图3 LncRNA MIR503HG通过调控miR-32-5p的表达影响H1299细胞的体外增殖与迁移

表3 LncRNA MIR503HG调控miR-32-5p对H1299细胞ITGA6、Vimentin、E-cadherin表达的影响

1～4:Normal组,LncRNA-mimic-NC组,LncRNA-mimic组,Lnc-mimic+agomir组

2.5ITGA6在NSCLC癌中表达 经GEPIA数据库分析显示,与ITGA6高表达的NSCLC患者相比,ITGA6低表达患者的生存曲线明显升高(P<0.05),见图5;Spearman相关性分析结果显示,NSCLC癌组织中ITGA6与LncRNA MIR503HG、Vimentin表达呈明显正相关(r=0.802、0.652,均P<0.05),与miR-32-5p、E-cadherin表达呈明显负相关(r=-0.792、-0.671,均P=0.000)。

图5 ITGA6表达影响NSCLC患者生存期

2.6miR-32-5p与ITGA6之间的双荧光素酶实验 miRDB生物信息数据库显示miR-32-5p和ITGA6能发生特异性结合。见图6。双荧光素酶实验结果显示,在升高miR-32-5p表达后,ITGA6(野生型)荧光素酶活性明显下降(P<0.05),TGA6(突变型)荧光素酶活性无明显变化(P>0.05),说明在NSCLC中,miR-32-5p靶向ITGA6表达。见表4。

图6 NSCLC中miR-32-5p与ITGA6的互补序列

表4 miR-32-5p与ITGA6双荧光素酶结果

2.7miR-32-5p靶向ITGA6影响H1299细胞的体外增殖与转移 细胞EDU染色增殖实验结果显示,与Normal组相比,agomir组、agomir+pc组EDU阳性细胞比例明显升高(P<0.05);与agomir组相比,agomir+pc组EDU阳性细胞比例明显升高(P<0.05)。细胞迁移实验结果显示,与Normal组相比,agomir组、agomir+pc组迁移细胞数量明显降低(P<0.05);与agomir组相比,agomir+pc组迁移细胞数量明显升高(P<0.05)。Western印迹实验结果显示,与Normal组相比,agomir组、agomir+pc组ITGA6、Vimentin表达水平明显降低,E-cadherin表达水平明显升高(P<0.05);与agomir组相比,agomir+pc组ITGA6、Vimentin表达水平明显升高,E-cadherin表达水平明显降低(P<0.05)。见图7、图8、表5。

1～4:Normal组、agomic-NC组、agomir组、agomiR-PC组

图8 miR-32-5p靶向ITGA6调控H1299细胞的体外增殖与转移

表5 miR-32-5p靶向ITGA6对H1299细胞中ITGA6、Vimentin、E-cadherin表达的影响

2.8LncRNA MIR503HG/miR-32-5p/ITGA6对肿瘤细胞体内生长与病灶转移的影响 与Normal组相比,LncRNA-mimic组、Lnc-mimic+agomir组、Lnc-mimic+agomir+pc组瘤体质量和病灶转移比例明显升高(P<0.05);与LncRNA-mimic组相比,Lnc-mimic+agomir组、Lnc-mimic+agomir+pc组瘤体质量和病灶转移比例明显降低(P<0.05);与Lnc-mimic+agomir组相比,Lnc-mimic+agomir+pc组瘤体质量和病灶转移比例明显升高(P<0.05)。Western印迹结果显示,与Normal组相比,LncRNA-mimic组、Lnc-mimic+agomir组、Lnc-mimic+agomir+pc组ITGA6、Vimentin表达水平明显升高,E-cadherin表达水平明显降低(P<0.05);与LncRNA-mimic组相比,Lnc-mimic+agomir组、Lnc-mimic+agomir+pc组ITGA6、Vimentin的表达水平明显降低,E-cadherin表达水平明显升高(P<0.05);与Lnc-mimic+agomir组相比,Lnc-mimic+agomir+pc组ITGA6、Vimentin表达水平明显升高,E-cadherin表达水平明显降低(P<0.05),见图9,图10,表6、图11。

1～5:Normal组、LncRNA-mimic-NC组、LncRNA-mimic组、LncRNA-mimic+agomir组、Lnc-mimic+agomir+pc组

1～5:Normal组、LncRNA-mimic-NC组、LncRNA-mimic组、Lnc-mimic+agomir组、Lnc-mimic+agomir+pc组

表6 各组瘤体质量、病灶转移与瘤体组织中ITGA6、Vimentin、E-cadherin相对表达

图11 5组H1299细胞体内病灶转移

3 讨 论

随着环境污染及生活方式的极大改变,肺癌尤其是NSCLC的发病率逐年升高。尽管NSCLC的预防、临床诊断、治疗均在生命技术的影响下出现了较为可喜的变化,但是疾病的分子机制尚未明确,治疗手段存在诸多限制,其5年生存率尚未令人满意,而大多数NSCLC患者经常规治疗后,仍具有较高的复发率和靶器官转移的风险。研究〔9〕显示,肿瘤细胞的无限增殖能力、对靶器官(尤以胃、乳腺等为主)的恶性侵袭能力是癌细胞最主要的恶性功能表型,也是导致患者失去生命的关键因子。因此,更为系统、深入的阐明NSCLC细胞增殖与转移的分子机制,及时而有效的加以安全高效的干预,是NSCLC临床治疗急需解决的挑战之一。

LncRNAs是由约为200个核苷酸组成的单链RNA,研究〔10〕显示,LncRNAs通过参与染色体修饰、基因转录水平及转录后的激活等过程参与细胞的增殖、侵袭与转移;而miRNAs是由22个核苷酸组成的单链生化小分子,研究〔11〕显示,miRNAs通过与靶基因的特异性位点结合,调控其表达或转录水平,在细胞增殖、侵袭、衰老及血管生成等生物学过程中发挥重要作用。随着人类基因组计划研究的深入,研究〔12〕显示,作为生物体内重要的非编码基因,具有庞大数量的LncRNAs及miRNAs的表达异常在机体癌症、组织损伤与修复、自身免疫性疾病等多种疾病中发挥重要作用。Zhao等〔13〕研究显示,在宫颈鳞状癌组织中LncRNA MIR503HG表达水平明显升高,表达异常升高的LncRNA MIR503HG促进宫颈癌的进展,沉默其表达后,能明显降低癌细胞的增殖活性。Qin等〔14〕研究报道,miR-32-5p在口腔鳞状细胞癌组织中的表达明显降低,升高其表达后,能明显升高口腔鳞状细胞中E-cadherin表达,下调口腔鳞状细胞中Vimentin表达,直接影响癌细胞上皮间质转化过程。细胞外基质的降解与重塑是肿瘤细胞恶性增殖及远处转移中的关键环节。作为整合素家族最为重要的成员,ITGA6定位于染色体2q31.1,其表达水平的高低与肿瘤进展及靶器官转移密切相关〔15〕。研究〔16〕显示,ITGA6不仅是细胞膜表面最关键的黏附分子,调节细胞间的黏附,还能增强促癌基因与信号的表达水平,调控肿瘤细胞增殖、分化、迁移与侵袭等生物学行为。Guo等〔17〕研究显示,ITGA6在肝癌组织中呈现高表达现象,并且高表达ITGA6增强了细胞体外增殖与转移活性。本研究得到类似结论。

综上,NSCLC中LncRNA MIR503HG、ITGA6表达明显升高,miR-32-5p表达明显降低,LncRNA MIR503HG靶向miR-32-5p调控ITGA6的表达影响H1299细胞的增殖与转移能力,但是如何将这一靶向作用用于NSCLC的临床诊断与治疗中,还需要结合更多的系统研究做出最为适宜的研判。