银杏总黄酮通过ERK/NF-κB信号通路对兔蛛网膜下腔出血后血管痉挛的影响

汤华 陈少军 韩晶 夏开来 姜莱 郑刚

(宜昌市第一人民医院神经外科,湖北 宜昌 443099)

脑血管痉挛常是蛛网膜下腔出血(SAH)的严重并发症之一,可造成患者大脑动脉平滑肌持续收缩,引发脑组织严重缺血缺氧,进而导致严重的神经功能障碍,是SAH患者残疾、死亡的主要原因〔1,2〕。SAH发生后,血液中红细胞溶解,释放出血红蛋白和血红素,诱导脑组织中氧自由基过量生成,引发严重的氧化应激,进而导致脑血管痉挛,且清除氧自由基,增强抗氧化能力是防治SAH后血管痉挛的有效方法〔3,4〕。银杏总黄酮具有扩张脑血管、促进血液循环、增加血流量的药理作用,还可增强脑细胞耐缺氧能力,减轻脑水肿,改善神经功能损伤〔5〕;有研究发现,使用银杏叶提取物联合奥拉西坦可改善急性脑出血患者认知功能,提高其生活质量〔6〕,因而推测银杏总黄酮可能对SAH后血管痉挛具有较好的疗效。细胞外调节蛋白激酶(ERK)/核因子(NF)-κB信号参与调控组织细胞凋亡、炎症、氧化应激等病理过程,增强ERK磷酸化,可促使NF-κB p65核转位,促进活性氧产生,引发严重的氧化应激反应;阻滞ERK/NF-κB信号传导,可减少炎性介质合成释放,减弱炎性细胞浸润,显著降低氧化应激水平〔7,8〕。并且有研究证明,抑制NF-κB信号激活,可缓解SAH后血管痉挛症状〔9〕,所以ERK/NF-κB信号可能是SAH后血管痉挛的一个潜在治疗靶点。本文探讨银杏总黄酮是否可通过ERK/NF-κB信号通路影响兔SAH后血管痉挛。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性家兔购买于湖南太平生物科技有限公司,生产许可证号:SCXK(湘)2015-0004,体质量2.4～3.0 kg。在宜昌市第一人民医院动物中心饲养,温度23～25 ℃,湿度55%～60%,参照《关于善待实验动物的指导性意见》规范饲养,饲养房中保证安静、清洁、通风良好。

1.2试剂与仪器 银杏总黄酮(纯度50%)由河南中医药大学中药实验室惠赠;3,4,5,4′-四甲氧基二苯乙烯(DMU-212,HY-137977)购于美国MedChemexpress公司;尼氏染色液(E607316-0100)、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(E607218-0200)、细胞核/质蛋白抽提试剂盒(C510001-0050)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白质定量检测试剂盒(C503021-0501)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(D799762-0100)购于上海生工生物工程股份有限公司;蛋白裂解液(P0013K)购于上海碧云天公司;山羊抗兔ERK一抗(26-5012)、山羊抗兔磷酸化(p)-ERK一抗(26-5013)、山羊抗兔NF-κB p65一抗(29-70006A)、山羊抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)一抗(10-M1083)购于上海信裕生物科技有限公司;小鼠抗兔GAPDH一抗(ab125247)、驴抗小鼠二抗(ab6820)、驴抗山羊二抗(ab6885)购于美国Abcam公司等。经颅多普勒血流分析仪(型号MultiDopX)购于德国DWL公司;冷冻切片机(型号6250)购于达科为(深圳)医疗设备有限公司;生物显微镜(型号XSP-8CA)购于上海光学仪器一厂;酶标仪(型号DNM-9602G)购于北京普朗新技术有限公司;DYY-3C型双稳定时电泳仪电源、DYCZ-20H型高通量垂直电泳仪、DYCZ-40S型四板转印电泳仪、WD-9413B型凝胶成像分析系统购于北京六一生物科技有限公司等。

1.3SAH兔模型制备及分组给药 制备SAH兔模型的方法参照文献〔10〕:自耳缘静脉注射3%的戊巴比妥钠溶液麻醉家兔(剂量为1 ml/kg),俯卧位固定在立体定位仪,头部备皮消毒,切开头皮,暴露颅骨枕大孔,以注射器针头刺入直至枕大池,吸出1～2 ml脑脊液,自耳缘静脉取血,注入枕大池,保持兔头部处于低位20～30 min,然后止血、消毒,缝合切口,放入笼中继续饲养48 h,以同样方法第二次注入自身血液,SAH模型构建完成,随机分为模型组、银杏总黄酮(156 mg/kg)组、DMU-212(ERK激活剂,18 mg/kg)组、银杏总黄酮(156 mg/kg)+DMU-212(18 mg/kg)组,每组6只。另取6只家兔以同样方法手术处理,只是将血液替换为等量无菌生理盐水,设定为假手术组。

将银杏总黄酮、DMU-212溶于生理盐水,分别制成31.2 mg/ml的银杏总黄酮〔11〕药液、3.6 mg/ml的DMU-212〔12〕药液、银杏总黄酮(31.2 mg/ml)+DMU-212(3.6 mg/ml)的混合药液,给药组兔以5 ml/kg的剂量灌胃给药,假手术组和模型组兔以等剂量生理盐水灌胃,每天上午给药1次,共持续7 d。

1.4兔神经功能检测 第7天给药后24 h,观察家兔行为活动,参照文献〔13〕方法进行神经功能评分:活动正常,无神经功能障碍,1分;不愿活动或嗜睡,有疑似或轻度神经功能障碍,2分;跛行或四肢无力,呈中度神经障碍,3分;四肢瘫软或行走障碍,呈重度神经障碍,4分。

1.5兔基底动脉血流速度测定 神经功能检测后,使用经颅多普勒血流分析仪测定兔基底动脉血流速度,将兔麻醉,以俯卧位置于操作台,暴露颈部,将连续波探头放入枕大孔处,深达28～30 mm,频率设为2.5 MHz,得到清晰的血流信号,统计平均血流速度。

1.6标本收集 兔基底动脉血流速度测定后,处死家兔,断头取出大脑,分离出海马组织,并剪下含基底动脉的脑组织,使用蒸馏水漂洗、OCT包埋后,分别放入冻存盒,以液氮进行冰冻,取出冻好的组织块,放入冰冻切片机中切为约4 μm厚的切片备用;剩余脑组织剪取约1 g,采用细胞核/质蛋白抽提试剂盒分别提取细胞核蛋白和细胞质蛋白,经BCA蛋白质定量检测试剂盒对其蛋白浓度定量后,保存在-80 ℃冰箱;剩余脑组织再剪取约0.5 g,储存在液氮中。

1.7兔脑组织海马神经元形态检测及兔大脑基底动脉痉挛情况检测1.6中海马组织及含基底动脉的脑组织切片,放入冰丙酮中固定,海马组织切片置于尼氏染色液中染色,含基底动脉的脑组织切片采用HE染色试剂盒染色,均参照各自说明书指导步骤进行操作,在生物显微镜下观察染色情况,采用软件Image Pro Plus6.0分析测量含基底动脉的脑组织切片中动脉血管的管壁厚度及管腔横截面积。

1.8兔脑组织氧化应激因子SOD、GSH-Px、MDA水平检测1.6中储存在液氮中的脑组织,加入蛋白裂解液,匀浆制成匀浆液,4 ℃离心后,取上清以试剂盒测定SOD、GSH-Px、MDA水平,参照各自说明书指导步骤进行操作。

1.9兔脑组织ERK/NF-κB通路蛋白表达情况检测1.6中保存在-80 ℃冰箱的蛋白样品液,经煮沸5 min变性后,各取20 μg蛋白,于110 V恒压下电泳后湿转,将转印膜放入3%牛血清白蛋白溶液中,37 ℃孵育2 h,然后将膜取出,分别以山羊抗兔ERK、p-ERK、NF-κB p65、PCNA一抗和小鼠抗兔GAPDH一抗溶液4 ℃孵育12 h,取出膜,置于Tris-HCl+吐温-20缓冲盐溶液(TBST)中漂洗3遍,以相对应的驴抗山羊二抗、驴抗小鼠二抗溶液37 ℃孵育2 h,取出膜,再次漂洗3遍,经化学发光试剂显色,放入凝胶成像分析系统中采集图像,并以ImageJ软件分析图像中蛋白条带灰度值,得出各组p-ERK/ERK、核内NF-κB p65蛋白相对表达量。

1.10统计学分析 采用SPSS24.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组神经功能评分 与假手术组相比,模型组神经功能评分明显升高(P<0.05);与模型组、银杏总黄酮+DMU-212组相比,银杏总黄酮组神经功能评分明显降低,DMU-212组兔神经功能评分明显升高(均P<0.05)。见表1。

2.2各组基底动脉血流速度 与假手术组相比,模型组基底动脉血流速度明显升高(均P<0.05);与模型组、银杏总黄酮+DMU-212组相比,银杏总黄酮组基底动脉血流速度降低,DMU-212组基底动脉血流速度升高(均P<0.05)。见表1。

2.3各组脑组织氧化应激因子 与假手术组相比,模型组脑组织MDA水平明显升高,SOD、GSH-Px水平明显降低(均P<0.05)。与模型组、银杏总黄酮+DMU-212组相比,银杏总黄酮组脑组织MDA水平明显降低,SOD、GSH-Px水平明显升高;DMU-212组脑组织MDA水平明显升高,SOD、GSH-Px水平明显降低(均P<0.05)。见表1。

2.4各组大脑基底动脉痉挛情况 与假手术组相比,模型组基底动脉表现出严重的痉挛现象,管壁明显增厚,管腔横截面积明显减小(均P<0.05)。与模型组、银杏总黄酮+DMU-212组相比,银杏总黄酮组基底动脉痉挛减轻,管壁明显变薄,管腔横截面积明显增大;DMU-212组基底动脉痉挛加重,管壁明显增厚,管腔横截面积明显减小(均P<0.05)。见表1、图1。

表1 各组神经功能评分、大脑基底动脉管壁厚度、管腔横截面积、基底动脉血流速度、SOD、GSH-Px、MDA水平

图1 5组各组大脑基底动脉(HE染色,×200)

2.5各组大脑海马神经元形态 假手术组大脑海马神经元轮廓清晰可见,排列整齐致密;模型组大脑海马神经元萎缩变小,数量明显减少,排列紊乱;与模型组、银杏总黄酮+DMU-212组相比,银杏总黄酮组上述病理情况改善,DMU-212组上述病理情况加重。见图2。

图2 各组大脑海马神经元(尼氏染色,×200)

2.6各组脑组织ERK/NF-κB通路蛋白表达 与假手术组比较,模型组脑组织ERK/NF-κB通路相关蛋白p-ERK/ERK、核内NF-κB p65蛋白表达明显升高(P<0.05)。与模型组、银杏总黄酮+DMU-212组,银杏总黄酮组上述指标表达降低(P<0.05);DMU-212组脑组织上述指标表达升高(P<0.05)。见图3、表2。

1～5:假手术组、模型组、银杏总黄酮组、DMU-212组、银杏总黄酮+DMU-212组

表2 各组脑组织ERK/NF-κB通路蛋白相对表达水平

3 讨 论

SAH是神经外科高发急症,大多因动脉瘤破裂引起,脑血管痉挛是其常见并发症,可引发患者脑梗死,导致脑组织严重损伤,损害神经功能,是SAH后致死、致残,造成不良预后的主要因素,对其发生机制进行深入研究,找到安全有效的防治方法,具有重大临床意义〔14,15〕。本研究结果表明,SAH可降低抗氧化因子水平,增强氧化能力,引发兔大脑严重的氧化应激反应,导致动脉血管痉挛、血流速度增快,进而造成神经功能障碍,揭示兔SAH模型建立成功。

氧自由基引发的氧化应激是导致SAH后脑血管痉挛的主要致病机制,抑制自由基产生,对抗氧化应激反应是缓解SAH后脑损伤的有效治疗手段〔15,16〕。银杏叶是用于止痛通络、活血化瘀的常用中草药,具有抗炎、抗肿瘤、扩张血管、抗氧化的药理活性,可保护脑组织免于缺血缺氧性损伤,黄酮类化合物是其主要活性成分,研究发现,银杏叶总黄酮可显著抑制脑缺血后氧化应激反应,改善脑组织病理改变,减轻脑损伤,以银杏叶提取物联合胞磷胆碱钠片还可治疗急性脑出血,改善患者神经功能缺损症状〔17,18〕,由此可认为,银杏总黄酮可能通过减轻氧化应激而缓解SAH后血管痉挛。本研究结果表明,银杏总黄酮可提高抗氧化因子水平,抑制氧化应激反应,缓解动脉血管痉挛,减轻脑组织神经元损伤,改善神经功能。

ERK/NF-κB通路是机体调控氧化能力、免疫炎症、血流动力学、细胞存活等的重要信号通路,下调其通路蛋白表达,可提升抗氧化活性,在SAH病理过程中,ERK信号激活,降低其磷酸化水平,可减少海马神经元凋亡,减轻脑损伤,改善神经功能,另外通过抑制NF-κB信号活性,减低其核转位,可减轻SAH引发的脑血管痉挛〔19,20,9〕,因而抑制ERK/NF-κB信号可作为防治SAH后脑血管痉挛的潜在治疗策略。本研究表明,ERK/NF-κB信号参与调控SAH后血管痉挛病理过程;而银杏总黄酮可抑制ERK/NF-κB信号激活,改善血管痉挛症状,且以银杏总黄酮和DMU-212联合处理SAH模型兔可逆转DMU-212对脑损伤和血管痉挛的加重作用,并减弱银杏总黄酮改善上述症状的作用,以上结果表明,银杏总黄酮可通过阻止ERK/NF-κB信号传导来减轻SAH后血管痉挛,修复神经功能。