基于TLR4/NF-κB信号通路探究壮药双路通脑方对缺血性脑卒中大鼠肠组织损伤及肠道菌群的影响

翟阳 莫雪妮 郑光珊 王凯华 胡跃强 邹敏 梅小平 舒建龙 马威 谢婷婷

(1广西国际壮医医院脑病科,广西 南宁 530200;2广西中医药大学;3广西中医药大学第一附属医院脑病科)

缺血性脑卒中发生由脑动脉闭塞引起,血流量的骤减导致氧气和能量衰竭,通过级联反应导致神经炎症和脑损伤,且伴随全身性免疫反应〔1〕。Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB信号通路与脑缺血等的神经炎症密切相关,缺血区域坏死的脑细胞会刺激TLR4受体活化,并促进下游NF-κB入核活化,引起炎症因子释放,进一步加重神经损伤〔2,3〕。而阻断TLR4/NF-κB信号传导能显著减轻脑缺血引起的组织损伤〔4〕。

缺血性脑卒中可引起肠道菌群构成改变,破坏肠道屏障结构,激活肠道免疫反应,引起全身性免疫反应〔5〕。而肠道菌群紊乱又能通过肠-脑轴加重神经炎症,进一步促进缺血性脑卒中病情进展〔6〕。另外,有益的肠道菌群还能通过调节T细胞免疫、释放短链脂肪酸(SCFA)等调节胶质细胞和神经元等生长和存活,减轻神经炎症程度和神经元损伤,有利于脑卒中后的恢复〔7〕。然而,除粪菌移植外,目前尚无其他疗法通过重塑肠道菌群实现对缺血性脑卒中的治疗。

双路通脑方(STP)为广西国际壮医医院基于壮药壮饮通自主研发的复方制剂,在院内用于缺血性脑卒中的治疗,临床效果显著〔8〕。然而其对缺血性脑卒中的治疗作用是否与肠道菌群相关,且其对TLR4/NF-κB信号通路的影响均不明确。本研究给予缺血性脑卒中大鼠STP治疗,观察其对大鼠肠道菌群、肠组织损伤及脑TLR4/NF-κB通路的影响,以探讨其治疗缺血性脑卒中的作用机制。

1 材料和方法

1.1动物 50只雄性SD大鼠,SPF级,体质量200～230 g,购自北京维通利华公司,许可证号:SCXK(京)-2016-0011。实验大鼠统一在12 h光/暗周期、温湿度恒定的标准动物房中由专人饲养,保证进食和饮水自由。

1.2主要试剂和仪器 STP颗粒由扶芳藤、桂枝尖、苍术、法半夏、茯苓、南山楂、田七、陈皮、黄花倒水莲、肉苁蓉、火麻仁、生姜、炙甘草组成(广西国际壮医医院自制)。肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、干扰素(INF)-γ试剂盒(上海生工生物公司);闭合蛋白(Claudin)-1、密封蛋白(Occludin)、TLR4、髓样细胞分化因子(MyD)88、p-NF-κB p65(Ser 536)、NF-κB p65、p-核因子κB抑制蛋白(IκB)、IκB(CST公司);紧密连接蛋白(ZO)-1、GAPDH、羊抗兔或小鼠IgG二抗(Abcam公司);Quant-iTTMdsDNA分析试剂盒(Invitrogen公司);琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen公司);粪便DNA提取试剂盒(天根生化科技公司);DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒(New England BioLab公司);分光光度计(Thermo公司);显微镜、超薄切片机(Leica公司)等。

1.3缺血性脑卒中模型的制备〔9〕SD大鼠称重后,用2%戊巴比妥钠(3 ml/kg)麻醉,麻醉后固定(仰卧位)在大鼠板上。将颈部中线皮肤切开,暴露左颈总动脉(CCA),并进一步分离颈内(ICA)、外动脉(ECA)。用4号尼龙线将CCA和ECA的近心端系紧,并在远心端穿上尼龙线。接着,在距与CCA与ICA分叉点约5 mm处对CCA做一个“V”字切口,将尼龙丝线(直径0.26 mm)从切口插入ICA约18 mm,维持2 h,以阻断脑中动脉血流,实现脑缺血。2 h后小心抽出尼龙丝线,认真缝合伤口。造模成功标准:清醒状态下大鼠的Zea Longa评分为1～3分。假手术(S)组仅进行暴露动脉的操作,不阻塞脑动脉血流。

1.4分组和给药 造模成功的IS大鼠随机分为低(7.16 g/kg)、中(14.33 g/kg)、高(28.66 g/kg)剂量STP组和模型(M)组,各10只。同时取10只大鼠为S组。根据STP临床成人剂量和人与动物体表面积等效计算法,得到大鼠的等效剂量为14.33 g/kg作为中剂量组的剂量,给药前将STP颗粒在温无菌水中充分溶解。在制作模型前30 min予以相应剂量壮药STP颗粒溶液灌胃,在大鼠成模清醒后1 h给予该颗粒灌胃,连续6 d,每天上、下午各1次。M组和S组同步灌胃无菌水。

1.5样本采集 各组大鼠,麻醉后通过颈总动脉取5 ml血液(n=10),处死大鼠并迅速在超净台中取结肠内容物进行肠道微生物群分析(n=10)。接着,每组随机选5只取结肠组织进行苏木素-伊红(HE)染色和Western印迹检测,取缺血侧脑组织进行Western印迹检测。剩下5只大鼠测量脑梗死体积。

1.6脑梗死体积测量 麻醉大鼠后断头取脑,洗净后放入脑模具中,以视交叉为起点,冠状位等距切出6片2 mm的脑片。置于2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中避光孵育30 min,时间进行一半时翻转1次切片,以保证切片均匀染色,再将脑片转移至4%多聚甲醛中固定,拍照。红色为正常脑组织,白色为梗死组织。使用ImageJ软件测量计算脑梗死比例。脑梗死比例(%)=缺血侧梗死脑组织面积/对侧大脑组织面积×100%。

1.7血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平检测 将血液样品离心收集上清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平。

1.8Western印迹检测 将脑组织或结肠组织转移至RIPA裂解液中制作匀浆液,离心后将上清分装至1.5 ml离心管中,即为总蛋白。测定浓度后,各组取20 μg脑组织或结肠组织蛋白与上样缓冲液煮沸后,上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),恒压电泳分离。电泳结束后切胶,恒流转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将膜浸泡在5%脱脂奶粉中摇床孵育1 h,转移至一抗(GAPDH、ZO-1、Occludin、Claudin-1、TLR4、MyD88、p-IκB、IκB、p-NF-κB p65、NF-κB)稀释液中摇床孵育1夜,第2日转移至二抗稀释液中摇床孵育1 h,随后转移至现配的ECL化学发光液中显影,在蛋白凝胶成像仪上曝光、拍照并分析条带灰度值。

1.9HE染色 将结肠组织固定后制作石蜡切片(4 mm/片),脱蜡、至水后分别放在苏木素、伊红染液中染色3 min,冲洗干净、脱水、透明、封片,在显微镜下拍照分析。

1.10微生物群DNA测序及分析 用粪便DNA提取试剂盒提取结肠内容物中微生物的总DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析所提DNA的完整性。使用Quant-iTTMdsDNA分析试剂盒对细菌16 S rRNA V3-V4区序列进行扩增反应,正向引物:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;反向:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。随后回收扩增产物,使用DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒构建文库,并使用Illumina MiSeq PE300测序平台进行高通量测序(由上海美吉生物公司完成)。按照97%的相似度对测序所得序列进行OTUs聚类分析和物种注释,并基于OTUs聚类结果分析肠道菌群的构成。

1.11统计学处理 采用GraphPad Prism8.0软件进行方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1STP对脑梗死比例的影响 与S组〔(0.00±0.00)%〕比较,M组脑梗死比例〔(15.61±2.59)%〕显著增加(P<0.05);与M组比较,中、高剂量STP组脑梗死比例〔(11.72±1.96%)%、(9.48±1.65)%〕显著降低(P<0.05),低剂量STP组〔(13.58±2.14)%〕无明显变化(P>0.05);高剂量STP组最低,后续以28.66 g/kg STP进行研究,见图1。

1～5:S组、M组、低剂量STP组、中剂量STP组、高剂量STP组

2.2STP对血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平的影响 与S组相比,M组血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平显著较高(P<0.05);与M组相比,STP组血清TNF-α、IL-6、INF-γ水平显著较低(P<0.05),见表1。

表1 3组TNF-α、IL-6、INF-γ水平比较

2.3STP对脑组织TLR4/NF-κB通路蛋白表达的影响 与S组相比,M组脑TLR4、MyD88蛋白表达及p-IκB/IκB、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平显著较高(P<0.05);与M组相比,STP组脑TLR4、MyD88蛋白表达及p-IκB/IκB、p-NF-κB p65/NF-κB p65水平显著较低(P<0.05),见图2、表2。

图2 Western印迹检测各组TLR4/NF-κB通路蛋白表达

2.4STP对结肠组织结构的影响 S组结肠黏膜完整连续,上皮细胞紧密、整齐排列,杯状细胞丰富,没有炎性细胞浸润。与S组相比,M组结肠黏膜部分破裂,上皮细胞分布疏松、不连续,杯状细胞形态变异、数量较少,伴有较多炎性细胞浸润。与M组相比,STP组结膜连续性及上皮细胞分布均有所恢复,杯状细胞形态和数量趋于S组,仅少量炎性细胞浸润,见图3。

图3 3组结肠组织结构(HE染色,×100)

2.5STP对结肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白表达的影响 与S组相比,M组结肠ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平显著较低(P<0.05);与M组相比,STP组结肠ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平显著较高(P<0.05),见表2、图4。

表2 3组TLR4/NF-κB通路蛋白、ZO-1、Occludin、Clauclin蛋白水平比较

图4 Western印迹检测ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白水平

2.6STP对肠道菌群的影响

2.6.1菌群多样性 M组香农多样性(Shannon)、辛普森多样性(Simpson)、物种多样性(Observed species)和Chao1指数均较S组显著降低(P<0.05);STP组Shannon、Simpson、Observed species和Chao1指数均较M组显著升高(P<0.05)。S组、M组和STP组菌群覆盖度(Goods coverage)指数均高于0.98,表明本研究的测序覆盖率较高,见表3。

表3 3组Shannon、Simpson、Observed species、Chao1及Goods coverage指数比较

2.6.2菌门相对丰度的差异性 与S组相比,M组厚壁菌门丰度显著升高,而拟杆菌门显著降低,厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)显著较高(P<0.05);与M组相比,STP组厚壁菌门丰度显著降低,而拟杆菌门显著上升,F/B值显著降低(P<0.05),见表4。

表4 3组各菌门相对丰度及F/B值比较

2.6.3菌属相对丰度的差异性 与S组相比,M组瘤球菌属、拟杆菌属、异杆菌属、艾克曼菌属丰度明显较高(P<0.05),双歧杆菌属、乳杆菌属、罗姆布茨菌属、梭菌属丰度明显较低(P<0.05)。与M组相比,STP组双歧杆菌属、乳杆菌属、梭菌属、瘤球菌属和异杆菌属丰度显著上调,艾克曼菌属丰度显著下调(P<0.05),见表5。

表5 3组优势属菌群相对丰度的比较

3 讨 论

缺血性脑卒中发生时,血流的突然中断会导致缺血区域神经元坏死或死亡,并导致临近区域发生血流减少、神经元萎缩变性等继发损伤,表现为脑梗死〔10〕。本研究表明,STP为治疗缺血性脑卒中的有效方剂,STP可改善缺血性脑卒中大鼠全身性炎症免疫反应,但其机制不明。缺血脑组织易产生大量炎症因子,这些炎症因子和坏死的脑细胞能激活TLR4,进一步通过MyD88将损伤信号传递至细胞内的核因子κB抑制物激酶(IKK),进而催化IκB磷酸化并使其与NF-κB解离,游离出来的p-NF-κB被活化,并在核定位序列的引导下进入细胞核,结合并启动细胞核内靶基因的转录和表达〔11,12〕。NF-κB的激活可导致TNF-α等的合成和释放,招募更多的免疫细胞向损伤部位聚集,增强神经中枢甚至全身的炎症免疫反应,进一步加重脑损伤〔13〕。本研究提示,STP的抗炎作用可能与抑制TLR4/NF-κB通路活化有关。

缺血引起的脑组织损伤及随后的修复过程,均涉及局部和全身性的炎症免疫反应参与〔14〕,因此,免疫调节可能是治疗脑卒中的新策略。肠道菌群作为肠道免疫系统的重要组成部分,可通过调节糖脂代谢,分泌蛋白、多肽、短链脂肪酸等调节机体的免疫反应〔15〕。缺血性脑卒中可导致肠道菌群失调,破坏肠道屏障,增加肠道通透性,促进肠黏膜免疫系统活化,释放炎症因子〔5,6,16〕;而肠道菌群紊乱也可通过“肠道菌群-肠-脑”轴促进脑卒中进展〔7〕。本研究表明,脑卒中可造成肠损伤和肠道菌群紊乱。而STP可恢复肠道菌群的多样性并减轻肠损伤。据报道〔17〕,F/B值增高会加重脑卒中小鼠的全身炎症和神经损伤程度。本研究提示,STP可有效降低F/B值,可能有利于减轻脑卒中后炎症反应。

肠道环境改变能引起肠道菌群改变及代谢紊乱,在炎症性肠道中,艾克曼菌的丰度与IL-6等促炎因子的含量同步增加,双歧杆菌干预则可有效减轻肠道炎症〔18,19〕。Chen等〔20〕发现,脑缺血猴肠道中拟杆菌属丰度增高,乳杆菌属丰度降低,伴随外周血中IFN-γ等炎症因子含量增高。研究已证实,外源性补充双歧杆菌、乳杆菌有助于减轻神经炎症、改善认知功能〔21〕。本研究STP干预下调了艾克曼菌属等促炎菌属的丰度,上调了双歧杆菌属等抗炎菌属的丰度,有利于减轻肠道免疫反应,进而通过肠-脑轴调节大脑微环境。另外,瘤胃球菌属、异杆菌属、艾克曼菌属、拟杆菌属等还可释放丁酸、丙酸等短链脂肪酸(SCFA)代谢物,而SCFA可进入脑组织,促进脑内神经营养因子的合成,有利于神经元及其他神经细胞的存活,减轻脑卒中相关损伤〔22〕。本研究结果提示,STP可能通过重塑肠道菌群,恢复肠道屏障,调节肠道免疫反应,抑制TLR4/NF-κB通路活化,减轻脑卒中后大脑及全身的炎症反应。