芳香化浊调气法对功能性腹泻大鼠AQP3、5-HT水平及血管活性肠肽表达的影响

马晓菲 杜艳茹 张晓利 崔建从 吴佳欣

(1河北省中医院,河北 石家庄 050000;2河北省中医药科学院)

功能性腹泻(FD)是常见的消化系统疾病之一,主要临床症状为排便次数增多和粪便性状改变,其体现了肠道的动力亢进〔1〕。流行病学研究表明,FP在全世界范围内发病率相对较高,我国显著低于欧美国家,但显著高于亚洲其他国家,严重影响了人类健康和生存质量〔2〕。目前临床常用治疗腹泻的药物为蒙脱石散,其虽能对消化道黏膜进行修复,改善临床症状,但单一用药见效较慢〔3〕。与西医对症治疗相比,中医通过对患者进行整体调节,在FD治疗中优势显著。芳香化浊调气法是从既往临床研究经验中总结而来,通过提脾运脾、调畅气机对患者进行治疗,是脾气健运,达到泄泻自止的效果〔4〕。研究发现,FD的发病因素中空肠对水运转的异常是主要原因之一,其中水通道蛋白(AQPs)是影响水液运转的重要蛋白通道之一,在肠道内广泛表达,可调控肠道水液代谢,AQP3是AQPs常见的一种亚型〔5〕。5-羟色胺(HT)大部分表达于胃肠消化系统中,介导人体胃肠活动〔6〕。研究发现,5-HT可促进胃肠道运动、参与内脏感觉神经传导、胃肠道对食物和水的吸收、分泌胃肠道消化液等作用〔7〕。但AQP3和5-HT在FP大鼠中的作用机制目前尚未见文献报道,本研究通过制备FP大鼠模型,并给予芳香化浊调气法干预,观察其对大鼠AQP3、5-HT和血管活性肠肽(VIP)的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 60只雄性Wistar大鼠购自北京维通利华技术有限公司,动物合格证号:SCXK(京)2017-0003。3周龄,SPF级,体质量190～210 g,饲养于河北省中医院SPF级实验动物中心,保持室温18～25 ℃,相对湿度50%～60%,普通级动物饲料饲养,饲养期间大鼠自由饮水进食,关照周期12 h∶12 h。大鼠均适应性饲养1 w后进行后续实验。

1.2药物 芳香化浊调气法由茯苓15 g、紫豆蔻15 g、百合15 g、白芍15 g、鸡内金15 g、藿香12 g、白扁豆12 g、大腹皮12 g、当归12 g、川芎9 g、砂仁9 g、炒白术9 g、乌药9 g、木香9 g组成(云南鸿翔一心堂药液股份有限公司),由医院制剂室加水煎煮10 min,经纱布过滤,于50 ℃环境下通过旋转蒸发仪蒸发至终浓度1.5 g/ml,于4 ℃环境保存备用;盐酸小檗碱片(云南明镜亨利制药有限公司);终浓度为0.3 g/ml的番泻叶煎液(成都中医药大学附属医院门诊中药房)。

1.3试剂和仪器 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国Rapidbio公司);生理盐水(成都科伦药业有限公司);SYNERGY H1型多功能全波段酶标仪(英国Bio Tek公司);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.4分组 将60只大鼠随机分为正常组(正常大鼠不做任何干预,给药时给予等量生理盐水干预),模型组(FD大鼠模型给予生理盐水灌胃),药物1组(模型组给予含生药0.5 g/kg芳香化浊调气方灌胃),药物2组(模型组给予芳香化浊调气法灌胃干预,剂量为生药1.0 g/kg),药物3组(模型组给予芳香化浊调气法灌胃干预,剂量为生药1.5 g/kg),对照组(模型组灌胃16.2 mg/kg盐酸小檗碱干预),每组10只,各组均1 d/次,连续7 d,第21天后进行后续实验。

1.5模型制备 模型组、药物1组、药物2组、药物3组和对照组制备FD大鼠模型。大鼠均单笼饲养,于笼下铺滤纸,给予大鼠25 ℃番泻叶煎剂灌胃,计量为每天3 ml/次,均连续灌胃14 d。于第15天停止灌胃,各组均正常饮食进水,观察第14～28天时大鼠的变化情况。评估造模前后大鼠粪便性状,包括24 h总便粒数、稀便数、稀便率、稀便级、腹泻指数,以判断腹泻模型制备是否成功。

1.6各组粪便性状指标观察 观察并记录笼下滤纸上大鼠粪便形状、总颗粒数、稀便颗粒数及滤纸上污迹范围,滤纸1 h更换一次,共观察6 h。

1.6.1Bristol粪便性状(BSS)评分 BSS评分标准依据Bristol粪便性状分型判断图,共分为7型,依次对应分值为1～7分,1型为分散的干球样便1分;2型为2分:团块样便;3型为3分:干裂的香肠样便;4型为4分:柔软的香肠样便;5型为5分:柔软的团块样便;6型为6分:糊状样便;7型为7分:水样便。

1.6.2稀便率 根据滤纸上的污迹程度判断稀便率,稀便率=稀便的粒数除以大便的总粒数。

1.6.3腹泻指数 腹泻指数=稀便率×稀便级。稀便级的判定方式:以滤纸上污迹直径确定稀便级数,共分为4级:1级<1 cm;2级≥1 cm且<2 cm;3级≥2 cm且<3 cm;4级≥3 cm,稀便级=该鼠所有稀便级数之和/稀便次数。

1.7血清及组织中VIP含量检测 粪便性状指标观察后麻醉各组大鼠,取腹主动脉血3 ml,于4 ℃环境下3 000 r/min离心20 min,收集上清液,用ELISA试剂盒检测血清中VIP含量。取血后打开大鼠腹腔,分别取胃窦、十二指肠、结肠和下丘脑组织,生理盐水冲洗,滤纸吸干表面水分,用生理盐水制备成组织匀浆,离心组织匀浆收集上清液。用全自动酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度(D)值,计算处对应的浓度值。

1.8肠道组织中5-HT含量检测 取血结束后,处死各组部分大鼠,开腹后快速取出回肠、近端结肠和远端结肠(距肛门0.5 cm)各1 cm标本,将组织切碎后用生理盐水制备呈组织匀浆,离心取上清液。采用ELISA法检测肠道组织中5-HT水平。

1.9免疫荧光检测结肠组织中AQP3表达 处死各组部分大鼠,打开腹腔,取距离盲肠3 cm处完整的结肠,将结肠组织固定于10%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋,切片机切成4 μm组织切片,脱蜡后置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复缓冲液中,置于微波炉内进行抗原修复。将自发荧光淬灭剂加入组织周围反应5 min,冲洗后用血清白蛋白(BSA)孵育30 min。在组织中加入AQP3一抗(1∶200),孵育于4 ℃湿盒内;洗涤后加入二抗孵育50 min。再次加入二异丙醇胺(DIPA)染液中避光室温孵育10 min。用抗荧光淬灭剂封片剂封片,置于荧光显微镜下观察。4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核在紫外线照射下呈蓝色,阳性表达为相应荧光素标记的红色。

1.10统计学方法 采用Graphpad priam8.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1一般情况观察 造模后大鼠出现活动减少,精神萎靡,呈缩肩拱背样,体质量下降,毛色无泽,粪便湿软或不成形;药物干预后各组一般状态得到明显改善。

2.2各组粪便性状指标比较 与正常组相比,模型组BSS评分、稀便率和腹泻指数均显著增加(P<0.05);与模型组相比,药物1组、药物2组和药物3组均不同程度降低,且药物3组降低最为显著(P<0.05);药物3组和对照组较无显著差异(P>0.05),见表1。

2.3各组肠道组织中5-HT含量比较 模型组回肠和结肠组织中5-HT含量较正常组显著增加(P<0.05);药物1组、药物2组和药物3组较模型组显著降低,且药物3组含量最低(P<0.05);药物3组和对照组相比较无显著差异(P>0.05),见表1。

2.4各组结肠组织中AQP3表达比较 模型组结肠组织中AQP3表达明显低于正常组(P<0.05);与模型组相比,药物1组、药物2组和药物3组均明显增加,且药物3组增加最显著(P<0.05);药物3组较对照组无明显差异(P>0.05),见表1、图1。

表1 各组BSS评分、稀便率和腹泻指数、5-HT、AQP3水平比较

图1 各组结肠组织中AQP3表达比较(免疫荧光染色,×400)

2.5各组血清及组织中VIP含量比较 模型组血清及胃窦、十二指肠、结肠、下丘脑组织中VIP含量较正常组显著降低(P<0.05);与模型组相比,药物1组、药物2组和药物3组均显著升高,且药物3组变化最显著(P<0.05);药物3组和对照组比较无明显差异(P>0.05),见表2。

表2 各组血清及胃窦、十二指肠、结肠、下丘脑组织中VIP含量比较

3 讨 论

FD在全球范围内有较高发病率,是常见的消化道功能性疾病,且在中国的发病率较其他亚洲国家明显升高。FD不仅病程长且反复发作,不仅严重影响患者的生活,且对国家和社会的经济造成沉重负担〔8〕。目前现代医学对FD的治疗有一定的短期疗效,但停药后极易复发,使现代医学在治疗FD时有一定限制〔9〕。中医将FD归属为“泄泻”范畴,脾病湿盛是其主要病机,外邪、内伤以致脏腑虚衰是该病出现的主要原因〔10〕。浊毒辨证理论认为,湿为浊之源,浊为湿之甚,二者相互转化,积湿为浊,湿遇毒而浊化,浊毒互结,久之则气机不畅、日久痰浊,从而损伤肺腑,以致胃失和降、脾不升清、气滞络阻、气滞络阻,由此可知,浊毒为其致病关键,治则以化浊解毒、清热通络〔11〕。芳香化浊调气法中的茯苓利水消肿、健脾渗湿,紫豆蔻开胃消食、化湿消痞,百合清心安神、养阴润肺,白芍养血敛阴、平抑肝阳,鸡内金涩精止遗、消食健胃,藿香芳香化浊、解暑止呕,白扁豆健脾利湿、止泻淡渗,大腹皮利水消肿、行气宽中,当归润肠通便、补血活血,川芎活血行气,祛风燥湿,砂仁温中止泻、化湿行气,炒白术燥湿利水、健脾益气,乌药温肾散寒、行气止痛,木香调中导滞、和胃健脾,诸药合用共奏燥湿化浊、健脾止泻效果。现代药理学研究显示,白扁豆中的有效成分能够起到抗菌、抗病毒效果,能够改善机体免疫功能,起到解毒、止泻、止呕效果。

中医对FD的诊断标准为粪便清稀,大便次数增加,甚至水样便;或表现为大便次数不多,粪质清稀;或表现为泻下完谷不化,有反复发作病史。本研究结果提示芳香化浊调气法可改善FD大鼠粪便性状。马晓菲等〔12〕研究证实,芳香化浊调气法在FD患者治疗中应用可提高临床疗效,降低中医证候积分和复发率,有效改善生活质量。

研究发现,VIP对胃酸的分泌和胃蠕动均有一定抑制作用,不仅可抑制胃运动,还能有效对胃排空进行减缓〔13〕。本研究结果显示,芳香化浊调气法可增加血清中和组织VIP含量,减弱腹泻大鼠胃蠕动。胡莹等〔14〕研究证实,可通过降低腹泻大鼠肠推进率,促进VIP的释放缓解肠道平滑肌收缩,改善腹泻。5-HT是一种重要的神经递质,胃肠道运动和胃肠道分泌功能有一定调节作用,当肠道内聚集大量的5-HT时会导致中毒反应,进而导致胃肠道动力、分泌功能性及内脏高敏感性异常,介导慢性便秘、腹泻等胃肠道功能性疾病的发生〔15〕。研究发现,腹泻型肠易激综合征大鼠模型中5-HT和褪黑素水平均高于空白组,肠道内大量5-HT可以使肠道收缩力增强,收缩幅度降低,通过降低肠道内5-HT水平可控制胃肠道的运动功能〔16〕。本研究结果显示,芳香化浊调气法可降低FD大鼠肠道内5-HT水平,进而对肠道的运动功能进行调节,与上述研究结果一致。

研究发现,AQPs可调控胃肠道内的水液代谢,可维持机体内水液含量保持在相对稳定的状态〔17〕。AQPs家族在空肠黏膜上皮细胞中广泛分布,其中AQP3是常见的亚型之一,可调节机体水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡等。文献显示,FD中AQP3表达明显低于正常大鼠,且腹泻越严重结肠AQP3的表达水平越低〔18〕。由此可见,肠道内AQP3水平降低可导致肠道水液重复吸收功能障碍的发生〔19〕。本研究结果显示,功能性腹泻大鼠肠道中AQP3水平显著降低,芳香化浊调气法可明显增加FD大鼠肠道中AQP3水平,进而增加肠道水液的吸收功能,调节水分转运,进而起到改善腹泻的作用。张琦等〔20〕研究证实,FD模型大鼠肠道内AQP3、AQP8水平显著降低,通过增加AQP3、AQP8水平可明显增加肠道对水的吸收功能,调节肠内外环境失衡。

综上,芳香化浊调气法可增加FD大鼠AQP3水平和FD水平,减少5-HT水平,对肠道水液吸收功能和运动功能进行改善,进而改善腹泻。