高压氧治疗对老年大鼠创伤性脑损伤后神经功能的改善作用及相关机制

於睿 汪东亮

(宿迁市第一人民医院 1高压氧科,江苏 宿迁 223800;2急诊科)

创伤性脑损伤已成为欧美国家的第三大致死原因,虽然在我国发病率低于欧美国家,但近年来也呈上升趋势〔1〕。老年人已进入衰老阶段,颅骨硬化导致对外力的缓冲能力下降,更易发生骨折且脑损伤较严重〔2〕。创伤性脑损伤具有很高的致残率和致死率,脑损伤后神经功能变化情况直接影响患者的预后水平〔3〕。高压氧治疗虽已在临床应用了较长时间,取得了一定治疗效果,能够降低患者致残率、减轻脑水肿程度、缩短意识障碍时间,提高患者生存率〔4〕;但关于高压氧治疗对老年创伤性脑损伤后神经功能的改善作用及相关机制的研究仍十分少见。本研究通过建立老年大鼠创伤性脑损伤模型,探讨高压氧治疗对创伤性脑损伤后神经功能的改善作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1动物与主要试剂 雄性SD大鼠90只,20～24月龄,平均体质量(350±20)g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SYXK(京)2022-0019,每日12 h光照,自由进食、进水。放射免疫沉淀(RIPA)裂解液购于北京赛文创新生物科技有限公司;鼠抗人脑源性神经营养因子(BDNF)单克隆抗体、兔抗人缺氧诱导因子(HIF)-α单克隆抗体、兔抗人半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3单克隆抗体、鼠抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2单克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体及山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG均购于上海铭修生物科技有限公司。

1.2创伤性脑损伤模型制作与分组 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠,剂量为50 mg/kg,在大鼠右侧颅顶钻开1个骨窗(直径约5 mm),保持硬膜的完整性,使用自由落体打击装置(冲击物30 g,自有落体高度15 cm)制作脑挫裂伤模型,骨蜡封闭骨窗,缝合头皮,继续常规喂养。将90只大鼠随机分为假手术组(只开颅、不打击,开颅后骨蜡封闭骨窗、缝合)、模型组、高压氧治疗组(造模后进行高压氧治疗),每组30只,各组内再根据研究时间窗分为12、24、48、72、120 h 5个亚组,每组6只。

1.3高压氧治疗方案 使用高压氧动物试验舱进行治疗,实验前先使用纯氧洗舱约5 min,检测高压氧舱中氧浓度高于96.6%,二氧化碳浓度低于0.05%后将高压氧治疗组放入舱内,设置压力0.2 MPa,给氧方式选择直排式,氧流量设置为5 L/min,温度控制在23～25 ℃,连续纯氧通风30 min后匀速调节压力至常压后出舱,每次12 h,每日固定时间段进出舱。

1.4水迷宫实验 待高压氧治疗组治疗结束后,3组大鼠各取6只进行水迷宫定位巡航实验和空间探索试验。定位巡航实验:实验前1 d大鼠在水池中自由游泳90 s,实验时间共5 d,每日训练4次,记录大鼠逃离潜伏期。第5天末次定位巡航实验结束后2 h进行空间探索试验,将水池中的站台取出,记录120 s内大鼠穿越原站台位置的次数、首次到达原平台时间。

1.5大鼠神经运动功能评分 参照Yakovlev等〔5〕方法并略加调整,评分系统包括4种动作:①大鼠在切坡站立5 s,根据完成时斜坡角度依次为正常(45 °)、轻度不能(30 °)、中度不能(15 °)、重度不能(<15 °);②大鼠可通过宽度1 cm(正常)、2 cm(轻度不能)、3 cm的平衡木(中度不能)、无法通过宽度3 cm的平衡木(重度不能);③提起大鼠尾巴的同时,测量大鼠外伤对侧前肢的反屈程度,依次计正常(90 °)、轻度不能(60 °)、中度不能(30 °)、重度不能(<30 °);④观察大鼠自发运动时的转圈行为,依次计正常(180 °)、轻度不能(120 °)、中度不能(60 °)、重度不能(<60 °)。正常计4分、轻度不能计3分、中度不能2分、重度不能1分。

1.6取材与处理 分别于脑外伤后12、24、48、72、120 h处死对应亚组大鼠,取大脑组织,留取海马组织后称湿质量,之后放入烤箱中105 ℃烘干24 h后称干质量,计算脑组织含水量(%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。海马组织常规进行石蜡包埋,用于BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白检测。

1.7Western印迹检测大鼠海马区BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达 放射免疫沉淀(RIPA)细胞裂解液提取3组海马区BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白浓度,行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,电转法将目标蛋白转移至聚偏氟乙烯膜,使用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液封闭1 h,滴加鼠抗人BDNF单克隆抗体(稀释倍数1∶500)、兔抗人HIF-α单克隆抗体(稀释倍数1∶1 000)、兔抗人Caspase-3单克隆抗体(稀释倍数1∶300)、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体(稀释倍数1∶500)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(稀释倍数1∶2 000),4 ℃孵培育过夜,次日滴加山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG,稀释倍数1∶4 000,室温下1 h,电化学发光法(ECL)显影,使用ImageJ软件读取各条带灰度值。

1.8统计学方法 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组水迷宫实验结果 各组第5天逃避潜伏期、穿越原站台位置次数、首次到达原平台时间差异均有统计学意义(P<0.01);其中模型组第5天的逃避潜伏期、首次到达原平台时间明显长于假手术组,穿越原站台位置次数明显少于假手术组;高压氧治疗组第5天逃避潜伏期、首次到达原平台时间明显短于假手术组,穿越原站台位置次数明显多于假手术组(均P<0.01)。见表1。

表1 各组水迷宫实验结果

2.2造模后不同时间点各组神经细胞凋亡情况比较 造模后24 h神经细胞凋亡比例达到峰值,之后逐渐下降;其中模型组神经细胞凋亡比例明显高于假手术组,高压氧治疗组明显低于模型组(P<0.05,P<0.01)。见表2。

表2 造模后不同时间点各组神经细胞凋亡比较

2.3造模后不同时间点各组神经运动功能评分比较 随着造模后时间的延长模型组、高压氧治疗组神经运动功能评分逐渐升高;其中模型组神经运动功能评分明显低于假手术组(P<0.05);造模后24 h起高压氧治疗组明显高于模型组(P<0.05)。见表3。

2.4各组脑组织含水量比较 造模后第5天各组脑组织含水量差异有统计学意义(P=0.028);其中模型组明显高于假手术组,高压氧治疗组明显低于模型组(均P<0.05)。见表3。

表3 造模后不同时间点各组神经运动功能评分及脑组织含水量比较

2.5各组海马区BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平比较 各组海马区BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05);模型组海马区HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平明显高于假手术组(P<0.01);高压氧治疗组大鼠海马区BDNF、Bcl-2蛋白表达水平明显高于模型组,HIF-α、Caspase-3蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.05)。见图1、表4。

图1 各组海马区BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达

表4 各组海马区BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达水平比较

3 讨 论

高压氧治疗是临床常用的治疗手段,能够促进脑外伤修复,减轻脑水肿、神经元变性,降低患者致残率和死亡率〔6〕。但目前关于高压氧治疗对老年创伤性脑损伤后神经功能的改善作用及相关机制鲜有研究报道。学习和记忆能力是人体最复杂的神经活动之一,脑部神经功能直接影响学习和记忆能力。动物行为学实验中常用的工具包括Morris水迷宫、Y迷宫等,其中Morris水迷宫在空间记忆能力评估中优势明显,属于长期记忆,由海马区决定〔7〕。本研究结果表明,经高压氧治疗后大鼠的学习记忆能力明显改善。

神经细胞凋亡参与了颅脑损伤后继发损害的病理过程,是学习和记忆能力下降的主要原因之一〔8〕。当创伤性脑损伤后脑组织水肿、血管床破坏等原因会引发局部脑缺血、缺氧,激活线粒体介导的细胞凋亡途径,引发神经细胞凋亡,神经运动能力降低〔9〕。脑水肿程度随着损伤时间的延长逐渐减轻,侧支循环也逐渐建立,在一定程度上恢复了损伤区域脑组织供血、供养,神经细胞凋亡比例逐渐下降,神经运动功能在一定程度上得到恢复〔10〕。高压氧治疗能够有效抑制创伤性脑损伤后神经细胞凋亡、促进神经运动功能恢复,可能与提高血氧浓度,促进血流速度,增加脑组织对氧的利用有关〔11〕。颅脑损伤会引发脑水肿,进而损伤脑组织,影响正常生理代谢和血氮水平〔12〕。本研究结果提示,老年大鼠创伤性脑损伤后脑水肿程度明显提升,高压氧治疗有助于减轻脑水肿程度。

BDNF属于神经营养素家族,具有促神经生长活性〔13〕。相关研究显示,BDNF具有神经保护作用,可促进受损神经组织的修复,减弱缺氧、自由基、细胞毒素等所致的脑损伤,作用机制包括维持钙平衡和自由基代谢等〔14〕。BDNF低表达会减弱神经元对损伤的抵抗作用,减弱神经元修复、增生活性〔15〕。HIF-α表达水平与人体组织中的氧体积分数呈负相关,正常氧体积分数下HIF-α低表达,很难被检测,在缺氧状态下其表达明显升高,可用于反映脑损伤程度〔16〕。目前已发现,线粒体途径、死亡受体途径等细胞内凋亡信号通路,活化凋亡执行因子Caspase-3是上述通路的重要步骤〔17〕。Bcl-2位于细胞器上游,调控下游Caspase-3活化,线粒体途径中Bcl-2是抗凋亡的关键因子〔18〕。本研究结果提示,老年大鼠创伤性脑损伤后海马区HIF-α、Caspase-3、Bcl-2高表达参与神经功能损伤的发生与发展过程。高压氧治疗可通过上调海马区BDNF、Bcl-2表达,下调HIF-α、Caspase-3表达,来发挥抑制创伤性脑损伤后海马区神经细胞凋亡,提高神经元修复、增生活性,进而改善神经功能。