miR-34a调控PI3K/AKT通路对口腔癌细胞生物学行为的影响及机制

梅冰馨 刘克华 张太阳

(赣南医学院第一附属医院口腔科,江西 赣州 341000)

口腔癌是一种预后较差的颌面部恶性肿瘤之一〔1,2〕。口腔癌病因及发病机制还未完全揭示,人们公认口腔卫生差、吸烟、酗酒等因素均可导致口腔癌发病〔3〕。虽然目前关于口腔癌的临床治疗已获得重大进步,然而该疾病患者5年生存率仍不足65%,给人类生命健康带来巨大的打击〔4〕。故探究口腔癌病因及发生机制已成为研究人员关注的重点课题之一。大量研究显示,微小RNAs(miRNAs)可通过发挥肿瘤基因或肿瘤抑制基因的作用进而参与肿瘤细胞增殖、分化、侵袭等相关环节〔5〕。miR-34a已被证实在肺癌〔6〕、结肠癌〔7〕等多种实体瘤中的表达异常下调,提示其可能是作为潜在的肿瘤抑制基因发挥作用。据报道,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路是和细胞增殖、侵袭及迁移等密切相关的信号途径,在肿瘤起病及演变过程中扮演关键角色。然而目前关于miR-34a调控PI3K/AKT通路对口腔癌细胞生物学行为的影响及机制研究较少,因此本研究对其进行探究。

1 材料与方法

1.1实验细胞 人口腔角质形成细胞HOK及人口腔癌细胞Tca8113、OEC-M1、OC3购于晶莱生物公司。细胞培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清)中,然后置于细胞培养箱中孵育并传代。

1.2主要试剂 Trizol试剂(北京启衡星生物公司);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(北京诺博莱德科技公司);PI3K、p-PI3K抗体(上海臻科生物公司);AKT、p-AKT抗体(深圳市豪地华拓生物公司);噻唑蓝(MTT)细胞增殖检测试剂盒(沈阳万类生物公司);0.25%胰蛋白酶(武汉普诺赛生命科技公司);放射免疫沉淀(RIPA)试剂(苏州近岸蛋白质科技公司);磷酸盐缓冲液(PBS)粉剂(上海信帆生物公司);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒(北京凯诗源生物公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(长沙艾碧维生物公司);聚合酶链反应(PCR)引物(武汉时胜生物公司)。

1.3细胞分组 将Tca8113细胞分为NC组、miR-34a NC组、miR-34a组,其中NC组不进行任何处理,然后分别将miR-34a模拟物对照物、miR-34a 模拟物染至miR-34a NC组、miR-34a组,转染完成后24 h进行后续实验。

1.4逆转录(RT)-PCR法检测细胞中miR-34a及PI3K/AKT相关因子相对表达量 取细胞通过Trizol试剂进行裂解处理,提取细胞总RNA并进行检测,随后经逆转录试剂盒合成cDNA,逆转录反应条件:25 ℃ 10 min,48 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min。将逆转录合成后的cDNA进行PCR,总反应体积为20 μl,反应条件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,预变性后,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40个循环。将GAPDH作为内参,相对表达量公式为2-△△Ct。引物序列由武汉时胜生物公司合成。引物序列为:miR-34a:上游5′-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3′,下游5′-CAGTGCGTGTC-GTGGAGT-3′;PI3K上游5′-GCGTGACATGTAGGCTCTCAG-3′,下游5′-CTATACGGCCCGCACTGTAA-3′;AKT上游5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′,下游5′-TT-GTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′;GAPDH上游5′-TCAAGAAGGT-GGTGAAGCAGG-3′,下游5′-TCAAAGGTG-GAGGAGTGGGT-3′。

1.5MTT法检测细胞增殖能力 取细胞植于96孔板,同时调整细胞密度为5×107个/ml,随后将其放入细胞培养箱中培养。分别于转染后24、48、72 h时取20 μl MTT溶液加入96孔板,4 h后将原有的培养基去除,并加入150 μl二甲基亚砜(DMSO),使其充分混匀后通过酶标仪在490 nm处检测每孔的吸光度。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡能力 将细胞植于6孔板并调整细胞密度为1×105个/ml,然后放入细胞培养箱中孵育,经0.25%胰蛋白酶消化后以2 000 r/min的速度离心10 min,去除上清液后通过PBS冲洗。经400 μl结合缓冲液重悬后加入5 ml膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC),充分混匀后置于流式细胞仪进行测定。

1.7划痕实验检测细胞迁移能力 取细胞植于6孔板并调整细胞密度为1×105个/ml,通过10枪尖在垂直于孔板底部画直线,然后通过PBS冲洗3次,每次5 min,在室温下孵育24 h后拍照并对细胞进行计数。

1.8Transwell实验检测细胞侵袭能力 实验前2 h需将小室湿化处理,2 h后将200 μl细胞悬液置于上室中,并于下室中加入细胞培养液(含10%胎牛血清),然后将Transwell小室置于培养基中孵育。24 h取PBS对小室进行冲洗并放入4%多聚甲醛中浸泡30 min。经结晶紫染色后置于显微镜下观察计数。

1.9Western印迹检测细胞PI3K/AKT相关蛋白表达 取RIPA裂解液裂解培养细胞并对细胞总蛋白进行提取,然后通过考马斯亮蓝染色法(Bradford)对所提取的总蛋白进行定量。将30 μg蛋白样品置于各个通道,经SDS-PAGE分离蛋白质并进一步转至PVDF膜,电转完成后采用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭处理1 h,加一抗并于4 ℃环境下过夜;加二抗置于室温下孵育1 h,随后于曝光仪中曝光处理,经ImageJ分析目标蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT表达量,以β-actin作为内参。

1.10统计学方法 采用SPSS22.0软件进行SNK-q检验、方差分析。

2 结 果

2.1miR-34a在不同细胞中的表达量比较 miR-34a在Tca8113、OEC-M1、OC3细胞中的表达(0.13±0.01、0.40±0.09、0.22±0.02)较HOK(1.00±0.15)明显减少(P<0.05)。

2.2转染后各组细胞miR-34a表达比较 miR-34a组细胞miR-34a表达(8.43±0.59)较NC组(1.00±0.01)明显升高(P<0.05)。NC组细胞miR-34a表达与miR-34a NC组(1.05±0.01)差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组不同时间点细胞增殖能力比较 在24、48、72 h时,miR-34a组细胞增殖率较NC组明显减少(P<0.05)。NC组细胞增殖率与miR-34a NC组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4各组细胞凋亡能力比较 miR-34a组细胞凋亡率较NC组明显增加(P<0.05)。NC组细胞凋亡率与miR-34a NC组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。

图1 各组细胞凋亡能力

2.5各组细胞迁移及侵袭能力比较 miR-34a组细胞迁移及侵袭细胞数均较NC组明显减少(P<0.05)。NC组迁移及侵袭细胞数与miR-34a NC组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

表1 各组增殖率凋亡率、迁移与侵袭细胞数及PI3K、AKT mRNA表达比较

图2 各组细胞迁移及侵袭(结晶紫染色,×200)

2.6各组细胞PI3K/AKT通路相关蛋白及mRNA表达 miR-34a组细胞PI3K、AKT mRNA及p-PI3K、p-AKT蛋白表达均较NC组明显减少(P<0.05)。miR-34a NC组细胞PI3K、AKT mRNA及p-PI3K、p-AKT蛋白表达与NC组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2、图3。

表2 各组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白达表达比较

图3 各组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达

3 讨 论

口腔癌是世界范围内六大常见恶性肿瘤之一,其可诱发语言、呼吸等功能异常,给患者及家庭带来沉重的负担〔8〕。卢怡等〔9〕报道显示,口腔癌形成与吸烟、饮酒、饮食结构、遗传等因素有关。目前临床针对口腔癌的诊断及治疗取得了进展,且患者临床表现得到一定程度改善,然而患者临床预后并未出现实质性变化,其5年生存率在既往的2～3年中处于不变的情况,生存周期较短〔10,11〕。大量报道显示,口腔癌形成及进展过程中涉及多基因、多因素相互影响〔12〕,然而关于其具体作用机制还未完全揭示,故揭示口腔癌形成及进展机制对口腔癌临床诊断及治疗尤为重要。近年来miRNAs成为肿瘤研究领域关注的热点及重点,有报道显示miRNAs在肿瘤形成及演变相关环节中扮演促癌因子或抑癌因子的角色,其可通过上调或下调靶基因表达进而参与肿瘤形成及进展过程〔13〕。miR-34a在低等生物至人类机体中均存在表达,其主要受肿瘤抑制基因p53控制,其已被证实在多类型实体瘤中表达量明显下调,可参与调控胃癌、肝癌细胞等生物学行为〔7,14〕。郝小军等〔7〕采用慢病毒转染的方式建立miR-34a过表达结肠癌细胞系,发现miR-34a可通过抑制上皮-间质转化进而抑制结肠癌细胞增殖、侵袭及迁移,可为结直肠癌患者临床治疗提供分子靶点。有研究〔15〕结果显示,miR-34a、miR-127-3p等6种miRNA均可分辨人乳头状瘤病毒阳性及阴性患者。但关于miR-34a在口腔癌发生过程中的作用机制研究较少,本研究结果说明,miR-34a可能是作为口腔癌候选肿瘤抑制基因发挥作用。由于miR-34a在Tca8113细胞中表达最低,且相较于其他口腔癌细胞,Tca8113细胞是一种低分化的肿瘤细胞系〔16〕,杨霞等〔17〕报道显示,肿瘤细胞增殖及凋亡失调在肿瘤形成及演变过程中具有重要作用。Iwamoto等〔18〕表明,口腔癌细胞增殖率较凋亡率明显增加,故抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡在口腔癌治疗过程中作用显著。本研究结果证实,miR-34a可显著阻断口腔癌细胞增殖并诱导细胞凋亡,在阻断肿瘤细胞增殖及进程中发挥重要作用,这与王康浴等〔19〕报道基本一致。Hong等〔20〕研究显示,肿瘤细胞侵袭及迁移是导致患者预后不理想的主要原因。尹克等〔21〕证实,80%左右的肿瘤患者癌细胞发生侵袭及迁移,故在临床治疗需降低肿瘤细胞侵袭及迁移。本研究结果说明,miR-34a可显著抑制口腔癌细胞迁移及侵袭能力。这与单连启等〔13〕报道基本一致。PI3K/AKT通路是细胞生存的途径之一,研究证实其在肺癌、肝癌等诸多实体瘤中异常激活〔22,23〕。在生长因子、激素等因素刺激下PI3K通路可被激活,其中AKT是该通路中极为重要的下游分子,当其被激活后可通过磷酸化诸多转录因子、酶等进而参与控制细胞增殖、凋亡等生物学行为〔24〕。本研究结果说明,miR-34a可抑制PI3K/AKT信号通路激活进而作用于口腔癌细胞生物学进展。miR-34a在口腔癌细胞中呈低表达,上调其表达可抑制口腔癌细胞增殖、侵袭及迁移能力并促进口腔癌细胞凋亡,其作用机制可能是通过抑制PI3K/AKT通路实现的。