RNAi 沉默 CCR3 对变应性鼻炎嗜碱性粒细胞迁移、活化及脱颗粒的影响

廖兵 杨春平 易韵 刘月辉 朱新华 刘建国 汪美群 刘轲 陈旭波 张皓 田小燕

(1南昌大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科,江西 南昌 330006;2江西省肿瘤医院妇瘤科)

变应性鼻炎(AR)是接触过敏原后,特异性个体产生大量IgE抗体,后者可介导组胺等炎症介质释放,激活免疫活性细胞和促炎细胞,在鼻黏膜发生Ⅰ型变态反应性的疾病。我国是AR高发地区,患病率较高,并且随着国家工业化程度提高而呈逐年上升趋势〔1〕,严重影响患者工作和生活质量。目前研究已了解变应性疾病的发病机制,但影响免疫反应的因素多样且复杂,尚有较多的关键问题亟待深入了解。目前尚未有研究对RNA 干扰(RNAi)基因沉默CC趋化因子受体(CCR)3对AR嗜碱性粒细胞功能进一步探讨,本研究使用RNAi技术沉默CCR3 基因来阻断CCR3/嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)路径,探索此过程中嗜碱性粒细胞在骨髓、外周血及鼻腔的募集、迁移及成熟过程的变化,探讨RNAi 沉默CCR3对AR嗜碱性粒细胞迁移、活化及脱颗粒的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 实验动物:8周龄的SPF级雄性健康小鼠共48只,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。恒温恒湿环境下分笼饲养,提供无菌饲料及饮水。本研究通过伦理委员会批准,符合动物伦理要求。主要试剂:Trizol 试剂购自上海信乎生物科技有限公司,苏木素-伊红(HE)试剂盒购自深圳逗点生物技术有限公司,放射免疫沉淀(RIPA)裂解液购自北京康为世纪生物科技有限公司,二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒购自广州翔博生物科技有限公司,逆转录试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司,慢病毒购自苏州吉玛基因科技有限公司。主要仪器:全自动研磨仪购自武汉赛维尔科技有限公司,凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司,蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司,透射电子显微镜购自日本HITACHI公司。

1.2构建AR模型 参考文献方法〔2〕,取36只小鼠建立AR模型:腹腔注射10 μg卵清白蛋白/4 mg氢氧化铝混合液进行基础致敏,2次/d,共14 d;于第21～27天以卵清白蛋白在鼻腔内进行局部激发。另取12只正常小鼠腹部注射或鼻腔滴入等体积生理盐水进行对照。最后1次激发试验后,观察小鼠鼻部症状表现,如短时间内出现持续抓鼻、摩擦、打喷嚏、鼻腔内有较多分泌物则判定为AR模型建立成功。

1.3设计并合成小鼠CCR3siRNA 根据NCBI 数据库,查出小鼠CCR3 mRNA 序列全长,并合成设计其siRNA基因引物序列(5′-3′)为:CCR3siRNA1正义链:GGGCUCUUUAGAUGUUUGATT,反义链:UC-AAACAUCUAAAGAGCCCTT;CCR3siRNA2正义链:GCUGAGAUGUCCCAAUAAATT,反义链:UUUAUU-GGGACAUCUCAGCTT;CCR3siRNA3正义链:GCCUGUGUUUCUAUCAUUATT,反义链:UAAUGAUAGA-AACACAGGCTT;CCR3siRNA4正义链:GCUGUA-UUAAUCCAGUAAUTT,反义链:AUUACUGGAU-UAAUACAGCTT。经前期实验,确定CCR3siRNA3抑制CCR3表达效果最好,故选用CCR3siRNA3作为本次研究的目标基因序列。

1.4CCR3siRNA干预及分组 建AR模型同时,于第0、7、14天,经鼻缓慢滴入20 μl CCR3siRNA对照试剂(对照组)、CCR3siRNA(干预组)和等量生理盐水(模型组);且在第21～28天激发试验3 h前,相应组别小鼠再次经鼻缓慢滴入20 μl CCR3siRNA对照试剂、CCR3siRNA和生理盐水,左右鼻侧各滴入10 μl。正常对照的小鼠在同样时间滴入生理盐水(正常组)。

1.5外周血、骨髓和鼻黏膜相关指标检测 实验结束后,利用异氟烷对小鼠进行麻醉,摘取眼球取外周血,室温条件下3 000 r/min离心10 min,收集上清液备用。利用颈椎脱臼法处死小鼠,取出鼻中隔黏膜组织,保存于冰箱中备用。暴露并剪取小鼠股骨和胫骨,往骨腔内注入生理盐水,收集骨髓冲洗液,保存备用。

1.5.1Western印迹检测CCR3蛋白表达 提取本实验获得的组织匀浆或血清总蛋白,使用BCA蛋白定量法,对提取的总蛋白进行定量测定。设置好浓缩胶电压和分离胶电压,进行烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转印。取聚偏氟乙烯膜用洗涤缓冲液洗膜,封闭、室温摇床孵育。 洗膜后,先后加入一抗、二抗,孵育后。聚偏氟乙烯膜表面滴入新鲜配制的化学发光液滴,并转移至成像分析系统中,采集图像并分析CCR3蛋白相对表达量。

1.5.2实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测CCR3 mRNA表达 提取本实验获得的组织匀浆或血清总RNA,根据cDNA逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA,再用荧光定量试剂盒扩增和定量,PCR引物序列(5′-3′)为:CCR3上游:5′-GCGTTTGGACATCAGCTTGA-3′,下游:5′-ACGAT-TGTTCCGAAGCTTTGG-3′;GAPDH上游:GAAGGTGAAGGTCGGAGT,下游:GAAGATGGTGATGGGAT-TTC;设置好PCR体系和反应条件。以2-ΔΔCt公式计算CCR3 mRNA相对表达量。

1.5.3ELISA检测组胺、类胰蛋白酶、白细胞介素(IL)-3和IL-5水平将本实验获得的组织匀浆或血清,用相应的ELISA试剂盒检测外周血和鼻黏膜组胺、IL-3、IL-5和类胰蛋白酶浓度。

1.5.4鼻黏膜形态学观察 收集鼻黏膜组织,用4%多聚甲醛固定,脱水、包埋、切片,制作鼻黏膜标本,并使用HE进行染色,在光学显微镜下观察小鼠鼻黏膜的病理变化。

1.5.5流式细胞仪检测CD34+细胞水平 收集骨髓和外周血,制作单个核细胞悬液,加入抗CD34+体标记细胞,采用流式细胞仪检测CD34+细胞水平。

1.6细胞实验 模型组最后1次激发结束时,提取骨髓嗜碱性粒细胞体外培养,在体外利用小鼠骨髓干细胞诱导获得高纯度的嗜碱性粒细胞。取对数期生长的的细胞分别加入CCR3siRNA(CCR3siRNA组)、CCR3siRNA对照试剂(CCR3siRNA对照组)和PBS 液(空白组)进行培养。采用甲苯胺蓝染色法观察细胞的成熟度,并按公式(脱颗粒百分率=脱颗粒细胞数/所计数的100 个细胞×100%)计算其百分率。

1.7统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1CCR3siRNA对AR小鼠CCR3表达的影响 在小鼠外周血、鼻黏膜和骨髓中,与正常组比较,模型组、对照组和干预组CCR3蛋白和mRNA表达水平明显升高(均P<0.05);与模型组和对照组比较,干预组CCR3蛋白和mRNA表达水平明显降低(均P<0.05)。见图1、表1。

图1 各组外周血、鼻黏膜、骨髓CCR3蛋白表达

表1 各组外周血、鼻黏膜、骨髓中CCR3蛋白及mRNA表达

2.2CCR3siRNA对AR小鼠鼻黏膜形态学的影响 正常组鼻黏膜组织结构完整,排列整齐,黏膜及黏膜下组织未见肿胀,组织少许或无炎性细胞浸润。与正常组比较,模型组和对照组鼻黏膜结构不清,黏膜及黏膜下层肿胀,可见炎性细胞浸润。干预组上述鼻黏膜结构被破坏,但较模型组和对照组有所改善。见图2。

图2 各组鼻黏膜(HE染色,×100)

2.3CCR3siRNA对AR小鼠组胺、类胰蛋白酶、IL-3和IL-5水平的影响 在小鼠外周血、鼻黏膜和骨髓中,与正常组比较,模型组、对照组和干预组组胺、类胰蛋白酶、IL-3和IL-5水平明显升高(均P<0.05)。与模型组和对照组比较,干预组组胺、类胰蛋白酶、IL-3和IL-5表达水平明显降低(均P<0.05)。见表2。

2.4CCR3siRNA对AR小鼠外周血和骨髓CD34+细胞表达的影响 在外周血和骨髓中,与正常组比较,模型组、对照组和干预组CD34+细胞百分率明显升高(P<0.05)。与模型组和对照组比较,干预组CD34+细胞百分率明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组外周血和鼻黏膜中组胺、类胰蛋白酶、IL-3、IL-5水平及外周血和骨髓CD34+细胞百分率比较

2.5CCR3siRNA对嗜碱性粒细胞脱颗粒的影响 与CCR3siRNA对照组〔(3.51±1.01)%〕和空白组〔(3.93±1.25)%〕比较,CCR3siRNA组脱颗粒细胞百分率〔(0.97±0.46)%〕明显降低(均P<0.05)。见图3。

图3 各组嗜碱性粒细胞脱颗粒(甲苯胺蓝染色,×200)

3 讨 论

以往研究中,过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性皮炎等变态反应疾病中的炎症组织均发现嗜碱性粒细胞的浸润〔3～6〕。有证据表明,在鼻腔受到变应原激发后辅助型T细胞(Th)2细胞连续性激活,嗜碱性粒细胞、T 细胞和树突细胞(DCs)的数量增多,在受到变应原激发后发挥效应细胞作用〔3〕。在正常情况下,嗜碱性粒细胞只存在于外周血中,且只有较少的数量,但其在发生变态反应疾病时,其亦迅速募集到炎症部位,同时释放足够数量的炎症介质,促使超敏反应发生。研究证明,CCR3/Eotaxin 轴在Th2 淋巴细胞浸润过敏的组织中具有重要作用,CCR3 作为Eotaxin 唯一结合的受体〔7,8〕,在介导嗜碱性粒细胞迁移具有关键作用,因此下调CCR3表达对改善AR症状具有潜在的治疗意义。RNAi是目前热门的基因阻断技术,具有沉默基因表达的功能。 RNAi 通过抑制重要基因表达,有望成为干预治疗变应性疾病的新方法。目前已有利用 siRNA 来治疗临床疾病的研究,其具有持续时间长的特点〔9,10〕。因此设想针对嗜碱性粒细胞趋化、合成、释放介质等功能的关键基因,采用 RNAi 抑制基因表达进行RNA 干预,控制嗜碱性粒细胞产生,从而消除其在变应性疾病发生发展机制中的作用。本研究结果提示,CCR3siRNA干预利于改善AR症状。此外,CCR3siRNA具有抑制CCR3表达的作用。

从免疫学角度了解AR,机体受到过敏源等体外环境因素影响,造成Th1/Th2 平衡失调〔11,12〕,导致以Th2 免疫反应为主导变应性炎症反应〔13〕。其他研究显示,Th2 细胞可分泌IL-3 、IL-5和IL-13 等细胞因子〔14〕,后者作用于嗜碱性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞产生多种生理学效应,包括AR的变态反应。本研究结果表明,CCR3siRNA可以减轻细胞因子引起的变应性炎症反应放大效应。嗜碱性粒细胞胞质内含嗜碱性颗粒,这些颗粒内含有组胺等致敏性物质,当细胞脱颗粒后胞膜随即破裂,致敏性物质向外周血和周围组织释放,持续加重过敏灶Ⅰ型变态反应的发生发展。本研究表明,CCR3siRNA在嗜碱性粒细胞脱颗粒具有重要作用,能影响释放组胺、类胰蛋白酶等致敏物质的释放。CD34+祖细胞在受到变应原刺激后CCR3表达增加,激活CD34+祖细胞由骨髓向血液中释放成熟的嗜碱性粒细胞〔15〕,后者经血液循环向气道迁移而在炎症组织聚集。表明CCR3/Eotaxin 途径在变应性疾病发病过程中促使CD34+祖细胞从骨髓中释放嗜碱性粒细胞过程中具有重要作用〔16〕。本研究表明,CCR3siRNA可以降低CD34+细胞表达,间而抑制嗜碱性粒细胞细胞活化。

综上,应用RNAi技术可以沉默CCR3表达,CCR3表达降低可抑制嗜碱性粒细胞细胞活化、迁移以及脱颗粒,利于改善AR症状。