槟榔提取物通过上调Max蛋白对口腔鳞癌细胞迁移、侵袭的影响

肖旭 李泽濛 刘佩 李鹏程

(海南医学院 1第一附属医院口腔颌面外科,海南 海口 570100;2第二附属医院口腔科)

口腔鳞癌全称为口腔鳞状细胞癌,在临床口腔科属于较为常见的口腔恶性肿瘤,其发生部位为人口腔颌面部位置,是由于口腔的鳞状上皮发生了恶变,从而发展为恶性肿瘤。口腔鳞癌在发生时会存在较高的侵袭及转移性,其发病率在口腔癌中占据90%居多〔1〕。现代随着医学方面的不断进步发展,已经显著降低该恶性肿瘤疾病的发病率,目前临床基本控制在50%左右〔2〕。临床对于口腔鳞癌的治疗常采用放疗、化疗及手术等方式进行治疗,但在治疗后患者5年的生存率相对较低,而在进行治疗的过程中通过相关的中药、植物的提取物能够通过实行靶向调控来达到抗癌效果〔3〕。槟榔属于棕榈科植物的一种,其主要生存于海南、云南西双版纳等热带雨林地区,而作为重要的槟榔在四大南药中位居首位〔4〕。槟榔自身存在较多人体所需的如槟榔碱、干露糖、氨基酸等多种营养元素及活性成分〔5〕。槟榔提取物能够通过对顺铂引导的口腔癌疾病产生一定的功效,并且能够升高机体内的自噬活性进行〔6〕。MYC关联因子X(Max)以蛋白的形态存在于机体内,会直接参与多种恶性肿瘤疾病的发生发展,但槟榔提取物是否可通过上调Max表达从而对口腔鳞癌细胞迁移、侵袭产生影响还尚未可知〔7〕。本研究探讨槟榔提取物通过上调Max蛋白对口腔鳞癌细胞迁移、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1研究对象 购买CAL127人口腔鳞癌细胞。(购买于中国丰晖生物公司)。实验试剂:(1)购买自海南新鲜干燥的槟榔果。将其进行去皮,随后进行称重,城中30 g的槟榔干果,将称重过后的槟榔干果置于4 ℃的去离子水中,进行60 min的机械研磨。将研磨后的槟榔提取物同故宫离心机以12 000 r/min,离心半径10 cm的条件下进行离心处理8 min,离心后获取槟榔上清液,并进行过滤,带过滤后置于-80 ℃冷冻干燥机内进行浓缩冻干,从而获取干燥且呈现出粉状的槟榔提取物。对粉状槟榔提取物进行称重,称重后将其与离子水进行溶解,回去最终的槟榔提取物水溶液,以1 mg/ml讲槟榔提取物保存至-25 ℃的低温中待用。(2)DMEM培养基(上海吉至生化科技有限公司),超级胎牛血清(郑州九龙生物制品有限公司)、RIPA蛋白裂解液、四噻唑蓝(购自Hyclone,美国),结晶紫染液、聚偏氟乙烯膜(购自碧云天生物技术研究所),血小板源性生长因子(P-PDGFB)、磷酸化血小板源性生长因子(PDGFR)β、细胞周期蛋白(Cyclin)D1蛋白、Max/GAPDH抗体,山羊抗大鼠ROCK一抗、兔抗鼠IgG二抗(均购自武汉纯度生物科技有限公司)。

1.2仪器设备 Multi-skan MK3型酶标仪(美国Thermo公司);Transwell小室(南京迅贝生物科技有限公司);CO2培养箱(河北慧采科技有限公司);培养板(阿尔法生物实验器材有限公司);BX53半电动荧光显微镜(上海仪景通光学科技有限公司);双垂直电泳仪(深圳市康初源有限公司)。

1.3方法 将购买的CAL127人口腔鳞癌细胞放置于含有10%的超级胎牛血清的DMEM培养基内进行培养,其培养的条件为:37 ℃、5% CO2条件下。当CAL127人口腔鳞癌细胞处于对数生长期时对其进行实验,在进行饰演的过程中将实验分为对照组、低、中、高浓度槟榔提取物(低、中、高浓度)组。对照组:将CAL127人口腔鳞癌放置于含有10%的超级胎牛血清的DMEM培养基内进行培养;低浓度组:在DMEM培养基内加入10 μmol/L槟榔提取物;中浓度组:在DMEM培养基内加入20 μmol/L槟榔提取物;高浓度组:在DMEM培养基内加入30 μmol/L槟榔提取物。各组均进行24 h的培养。

1.4Max相对表达量检测 采用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)法测定Max相对表达量,采用Max试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)提取血液内RNA,用RT-qPCR试剂盒进行反转录反应,将cDNA,产物进行PCR扩增。条件参数为预火95 ℃预变性10 min,取出降温至85 ℃,变性5 s,迅速降温至60 ℃,退火15 s,温度保持50 ℃,延伸45 s,35个循环,重复实验3次。内参GAPDH上游引物:5＇-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3＇,下游:5＇-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3＇;Max上游引物:5＇-CCTGGGCCCTAGGAAATGAG-3＇,下游:5＇-TAGAGCAGGCGTGGTCCAG-3＇。以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt方法计算Max相对表达量。

1.5检测细胞迁移 通过进行划痕实验检验胃癌细胞株的迁移能力,选取胃癌细胞株用胰蛋白酶分解,获取细胞悬液接种到6孔板上,并用1.60 ml移液器枪头对所有单层细胞从上至下画一条划痕,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤刮下细胞,向干净培养基中加入4 ml溶液,37 ℃下培育29 h,弃去培养液,在显微镜下观察并记录视野平均值,重复3次,取细胞迁移数平均值。

1.6检测细胞侵袭 在24孔板中放置Transwell小室,在Transwell小室层中加入50 μl的基质胶,并在37 ℃ 5%的CO2的培养箱中过夜,直到基质胶完全凝固,然后在24孔下室中加入500 μl含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液,Transwell小室中加入100 μl的胃癌细胞悬液,48 h以后吸除24孔板下室中的培养液,用0.1%的结晶紫溶液进行染色6 min,对口腔鳞癌细胞的侵袭个数进行观察。

1.7Western印迹法测定PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白相对表达量 转染48 h后提取蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。与缓冲液混合100 ℃煮沸5 min后电泳。在90 V、4 ℃下靶蛋白转移至NC膜上,转膜时间为90 min,封闭:5%胎牛血清白蛋白,室温孵育60 min。经NC膜放置在1∶900稀释一抗中4 ℃进行孵育。二抗室温1 h后显色。对细胞凋亡相关蛋白PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1相对表达量进行检测。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0软件进行独立样本t检验、方差分析。

2 结 果

2.1各组Max蛋白表达对比 与对照组(1.02±0.23)相比,低、中、高浓度组Max蛋白表达(2.34±0.38、3.57±0.47、4.81±0.52)均升高,具有统计学差异(P<0.05);与低浓度组相比,中、高浓度组Max表达均升高,具有统计学差异(P<0.05);与中浓度组相比,高浓度组Max表达升高,具有统计学差异(P<0.05)。

2.2各组口腔鳞癌细胞迁移能力对比 如表1、图1所示,与对照组相比,低、中、高浓度组口腔鳞癌细胞迁移能力均降低,具有统计学差异(P<0.05);与低浓度组相比,中、高浓度组口腔鳞癌细胞迁移能力均降低,具有统计学差异(P<0.05);与中浓度组相比,高浓度组迁移能力降低,具有统计学差异(P<0.05)。

2.3各组口腔鳞癌细胞侵袭率对比 如表1、图2所示,与对照组相比,低、中、高浓度组口腔鳞癌细胞侵袭个数均降低,具有统计学差异(P<0.05);与低浓度组相比,中、高浓度组口腔鳞癌细胞侵袭个数均降低,具有统计学差异(P<0.05);与中浓度组相比,高浓度组侵袭个数降低,具有统计学差异(P<0.05)。

2.4各组口腔鳞癌细胞周期分布情况对比 如表1所示,高浓度组口腔鳞癌细胞处于G0/G1期均高于对照组、低、中浓度组(P<0.05);高浓度组口腔鳞癌细胞处于S期均低于对照组、低、中浓度组(P<0.05);低浓度组口腔鳞癌细胞处于G2/M期高于对照组、中、高浓度组,高浓度组口腔鳞癌细胞处于G2/M期低于对照组、低、中浓度组,具有统计学差异(P<0.05)。

2.5各组口腔鳞癌细胞增殖、凋亡率对比 如表1所示,与对照组相比,低、中、高浓度组口腔鳞癌细胞增值率均降低,凋亡率均升高,具有统计学差异(P<0.05);与低浓度组相比,中、高浓度组口腔鳞癌细胞增值率均降低,凋亡率均升高,具有统计学差异(P<0.05);与中浓度组相比,高浓度组增值率均降低,凋亡率均升高,具有统计学差异(P<0.05)。

表1 各组口腔鳞癌细胞迁移、侵袭能力、细胞周期分布、增殖及凋亡率对比

图1 各组口腔鳞癌细胞迁移(×200)

图2 各组口腔鳞癌细胞侵袭(结晶紫染色,×200)

2.6各组口腔鳞癌细胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表达对比 如表2、图3所示,与对照组相比,低、中、高浓度组口腔鳞癌细胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表达均降低,具有统计学差异(P<0.05);与低浓度组相比,中、高浓度组口腔鳞癌细胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表达均降低,具有统计学差异(P<0.05);与中浓度组相比,高浓度组口腔鳞癌细胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表达降低,具有统计学差异(P<0.05)。

表2 各组口腔鳞癌细胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表达对比

图3 各组口腔鳞癌细胞PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表达

3 讨 论

口腔鳞癌在当前临床中的发病率相对较高,并且患者在进行治疗后的5年生存率相对较低,并且会出现癌转移而造成死亡,临床致死率也相对较高〔8〕。因此临床相关医师进行多种相关实验寻找较具疗效的治疗药物,缓解患者疾病严重程度〔9〕。槟榔提取物时从槟榔果中提取而来,据相关研究表明〔10〕,当槟榔碱的浓度在10 μmol/L时,能够对口腔黏膜成纤维细胞的增殖情况产生促进作用,但也有相关研究得出〔11〕,槟榔碱也会对口腔黏膜成纤维细胞的增殖情况进行抑制。

Max蛋白以蛋白的形态存在于机体内的细胞中,而相关研究指出〔12,13〕,Max蛋白在机体内属于抑癌基因的一种,并且在机体出现癌变时,参与癌变全过程,能够对癌细胞的分化和生长进行一定程度的调控。本研究结果表明,口腔鳞癌细胞中Max蛋白表达呈现上调趋势,而对Max表达进行阻断且降低槟榔提取物的浓度,其口腔鳞癌细胞的迁移和侵袭能力相对减弱。

细胞周期分为3个:DNA合成前期(G1/G0)、合成期(S)、合成后期(G2/M),S期是机体内细胞进行分裂增殖的重要时期,在这一时期前将细胞阻滞能够有效地抑制癌细胞的发展〔14,15〕。相关研究显示〔16,17〕,Max能够有效地调控CAL127细胞改变癌细胞的周期分布。本研究结果说明,上调Max蛋白能够降低口腔鳞癌细胞的相对表达量,能够起到改变癌细胞周期分布的作用。

据相关研究指出〔18〕,采用不同浓度的虫草素提取物对口腔鳞癌细胞的增殖、侵袭及迁移情况进行分析,高浓度虫草素能够显著降低癌细胞的增殖率、迁移及侵袭能力〔19,20〕。本研究结果提示,槟榔提取物可能存在对口腔鳞癌细胞的迁移能力、侵袭个数进行抑制,从而达到相关治疗效果。本研究还提示,不同浓度的槟榔提取物对口腔鳞癌细胞的增殖率也能够产生降低作用,对腔鳞癌细胞凋亡率能够产生升高作用,并且会随着浓度升高,其增殖率会逐渐降低、凋亡率逐渐升高。并能抑制PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白表达。而在高浓度下的Max蛋白表达也呈现升高状态,其表达高于对照组、低、中浓度中的Max表达。PDGF在机体内以分裂原形态存在,并且能够促进体外平滑及纤维细胞的分裂。据相关研究表明,PDGFB、p-PDGFRβ之间所产生的相互作用,能够对癌细胞的迁移、侵袭能力产生关键作用。本研究结果显示,PDGFB、p-PDGFRβ、CyclinD1蛋白在口腔鳞癌细胞迁移、侵袭中具有重要作用。

综上,不同浓度的槟榔提取物可通过上调Max蛋白的表达而对口腔鳞癌细胞的迁移、侵袭进行不同程度的抑制。