枸杞子潜在燥性反应对小鼠特性表征的影响

张予心 杨兰 靳雯棋 赵一名 孙立伟 刘芳兵

(长春中医药大学 1附属医院实验中心,吉林 长春 130012;2药学院;3东北亚中医药研究院)

燥性反应常出现口腔溃疡、牙龈及咽喉肿痛、眼睛红肿干涩、流鼻血、尿赤、便干等一系列症状,时常伴有全身性反应症候〔1,2〕。现有研究表明,引起燥性反应的生物机制与体内炎症反应、氧化应激、激素调节、能量代谢等密切相关〔3～6〕,这一系列生理生化反应的失衡造成了人体亚健康状态〔4～6〕。导致燥性反应的因素有很多,如环境、饮食、精神状态等,而其中最关键的因素是体质。老年人体质逐渐衰弱,身体代谢能力、抗应激能力均不足,体内微环境长期处于炎症状态或自由基过剩,更容易产生燥性反应〔7,8〕。据《本草纲目》记载,枸杞子“能补肾、润肺、生精、益气”,其作为药食同源的滋补佳品深受民众喜爱〔6〕,特别是老年群体多喜用枸杞子泡水代茶或煲汤等。但确有部分人群服用枸杞子后出现燥性反应症状,表现为流鼻血、口干、咽喉肿胀、眼睛红胀不舒服等症状,极大地制约了枸杞子的广泛应用〔9,10〕。目前,服用枸杞子发生燥性反应现象的描述尚不完全。为更好认识枸杞子产生燥性反应的实质,本研究选择最具代表性的干姜、肉桂、附子热性药方剂作为诱发燥性反应的阳性对照药,其药性辛热燥烈,长期服用会诱发燥性反应症状〔11〕。本研文拟分析枸杞子潜在燥性反应对小鼠特性表征的影响。

1 材料与方法

1.1材料 仪器:真空冻干机,SCANVAC,沈阳基因有限公司;离心机,Centrifuge 5810 R,德国Eppendorf AG;酶标仪,Infinite M200 PRO,澳大利亚TECAN;石蜡包埋机,JB-P5,武汉俊杰电子有限公司;组织切片机,RM2016,上海徕卡仪器有限公司;光学显微镜,M8,德国PreciPoint。试剂:枸杞子、肉桂、附子、干姜购于北京同仁大药房;酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购于江苏酶免实业有限公司;4%多聚甲醛、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒、Triton-X-100购于北京索莱宝科技有限公司;羊血清购于美国Thermo Scientific;CD68一抗和二抗购于武汉Proteintech。动物:雄性10月龄C57BL/6小鼠购自沈阳长生生物技术有限公司,饲养于SPF级动物房,恒温(25±2)℃,恒湿(55±5)%,光照周期12 h,自由摄取食水,适应期7 d。本研究所有动物实验操作符合长春中医药大学动物伦理委员会规定。

1.2枸杞子提取物的制备 将100 g枸杞子以1 L水煮沸1 h,将煎液倒出,再加1 L水煮沸1 h,将两次煎液合并,以8 000 r/min离心,弃沉淀,将提取物制成冻干粉,称量后置于干燥处备用。

1.3热性药煎液的制备 取肉桂、附子、干姜各30 g,加水900 ml,同1.2中方法制备。

1.4动物实验 将40只小鼠随机分为空白组、热性药方组(1.5 g/kg)、枸杞低剂量组(1.8 g/kg)、枸杞高剂量组(3.6 g/kg),每组10只,每天上午灌胃给药,空白组给予等量盐水。每天灌胃1次,称体质量、食物重量、饮水量,测量肛温,连续14 d。第15天处死小鼠,取血液与组织样本。

1.5粪便含水量 收集各组小鼠新鲜粪便,称量等量新鲜粪便,经冻干,称量冻干粪便重量,含水量=新鲜粪便重量-冻干粪便重量。

1.6生化指标检测 各组血液在37 ℃放置30 min,3 000 r/min离心10 min取血清。按照ELISA试剂盒说明书步骤,于450 nm波长处,分别检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6、CC家族趋化因子配体(CCL)2、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)。

1.7脾脏指数 称量各组脾脏重量,取与第15天各自体质量的比值,脾脏指数=脾质量/第15天体质量×100%。

1.8HE染色 将脾组织放入4%多聚甲醛,浸泡24 h,然后经酒精脱水、二甲苯透明化、石蜡包埋后,制成5 μm厚的冠状切片,再经二甲苯与酒精脱水,然后进行苏木素染色,氨水返蓝,伊红染色,最后风干封片,光学显微镜下观察组织结构。

1.9免疫组化 将脱水后的石蜡切片用0.3% Triton-X-100孵育30 min,用5%羊血清封闭2 h,然后在4 ℃孵育CD68一抗过夜,第2天室温孵育二抗2 h,最后光学显微镜下观察染色结果。

1.10统计学方法 采用SPSS19.0软件进行ANOVA检验。

2 结 果

2.1枸杞子提取物引起小鼠燥性反应体征变化 从小鼠形态上观察,空白组毛发顺滑油亮,热性药方组毛发干燥,枸杞低剂量组毛发未见异常,然而枸杞高剂量组干燥。与空白组比较,热性药方组、枸杞子高剂量组体质量显著下降,饮水量显著升高,热性药方组进食量显著降低(P<0.05);体温略有升高但无统计学差异(P>0.05)。各组粪便含水量均无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组燥性反应体征及脾脏CD68表达、脾脏指数比较

2.2枸杞子提取物引起小鼠脾脏的病理变化 空白组脾脏红髓与白髓界限分明,脾小体清晰完整,无巨噬细胞浸润,脾窦无异常扩张,细胞分布均匀。热性药方组脾血窦增多,细胞排列略散乱,但红髓与白髓较分明,无巨噬细胞浸润,与空白组相比无显著差别。枸杞低剂量组无明显异常,与空白组相比红细胞更充盈。枸杞高剂量组脾脏红髓与白髓界限模糊,脾小体轮廓不清晰,有巨噬细胞浸润(黑色箭头),有几处血窦扩张(黄色箭头)。见图1。空白组、热性药方组与枸杞低剂量组脾脏中单核/巨噬细胞标志物CD68表达量很低,而枸杞高剂量组较空白组显著升高(P<0.05)。枸杞高剂量组脾脏指数也显著高于空白组(P<0.05),阳性药方组、低剂量组与空白组无统计学差异(P>0.05)。见表1。

图1 各组脾脏病理

2.3枸杞子提取物引起小鼠体内炎症反应 热性药方组和枸杞高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6及CCL2水平显著高于空白组(P<0.05);枸杞低剂量组TNF-α和IL-1β水平显著高于空白组(P>0.05),见表2。

2.4枸杞子提取物引起小鼠体内氧化应激损伤 与空白组相比,热性药方组及枸杞高剂量组SOD、CAT及GSH-px水平显著降低,MDA水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);枸杞低剂量组CAT水平显著降低(P>0.05),见表2。

表2 各组炎症因子及氧化应激反应指标比较

3 讨 论

枸杞子作为补品深受老年人喜爱,但过量摄入可能会出现燥性反应症状,如口干咽痛、眼睛肿胀、头疼等〔9〕。本研究显示,给予老年小鼠低剂量(药典规定剂量)和高剂量(2倍药典规定剂量)枸杞子提取物,与经典热性药方体征相似。结合现代医学理论,燥性反应是一种机体稳态失衡的表现,然而老年人机体很容易因为饮食不当而产生稳态失衡〔3,8〕。机体的稳态是由体内各种生理生化反应及各个组织相互维系,任何一个器官或生理反应的异常,都会导致燥性反应证候〔4,6〕。脾是人体重要的免疫器官,脾脏组织的变化可直接影响机体免疫功能,脾胃不和者过量食用枸杞子容易燥性反应〔9,12〕。

炎症反应是机体进行自我保护的最重要反应之一,当受到异物入侵,多种炎症因子、趋化因子水平升高,参与抵抗外物侵袭〔13〕。当机体内自由基过多,氧化反应超过抗氧化作用会导致氧化应激,抗氧化酶类活性降低,机体产生大量氧化中间产物,参与多种疾病过程,还促进牙龈肿痛、大便干结等燥性反应症状〔14〕。

枸杞子虽滋补,但过量食用会导致脾湿加重,滋生内火,老年人阴液不足者更易引发燥性反应。依据现代医学理论,过量食用枸杞子引发炎症反应和氧化应激,然而老年人抵抗应激能力下降,易诱发“燥性反应”证候。本研究通过对小鼠体征变化、脾组织病理变化的观察及炎症反应、氧化应激检测,首次阐释了过量食用枸杞子引起燥性反应的作用机理。然而,燥性反应的生物内涵十分复杂,更深层的作用机制还有待进一步研究。