基于STAT3信号通路研究柠檬苦素对胃癌模型小鼠免疫因子表达的影响

刘雪 石柳 林晔 张静智 温建军

(赣州市人民医院消化内科,江西 赣州 341000)

胃癌早期无明显症状,随病情进展逐渐出现消化不良等胃部不适症状,晚期出现疼痛、呕吐,甚至呕血、黑便、腹部肿块、上腹压痛、脾肿大和黄疸及远处淋巴结转移、盆腔转移等体征〔1,2〕。大部分胃癌患者确诊时已到晚期〔3〕,常采用手术治疗,但对于晚期患者而言,术后易出现复发和转移,并且预后不佳,所以必须辅以药物治疗〔4～6〕。现阶段临床所使用的化疗药物副作用较大,患者不宜耐受,所以寻找毒副作用小且效果好的药物成为重中之重〔7〕。柠檬苦素具有抗肿瘤、昆虫拒食、抗病毒、镇痛、抗炎、催眠等多种生物活性〔8～10〕。有研究显示〔11〕,柠檬苦素能抑制多种癌症细胞系生长。且研究还指出〔12〕,柠檬苦素抑制癌细胞可能与阻断信号转导与转录激活因子(STAT)3通路激活有关。本研究旨在分析柠檬苦素对胃癌小鼠模型免疫因子表达的影响,并初步探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验用细胞为MFC小鼠胃癌细胞,购自攸碧艾(上海)贸易有限公司,货号U30042。SPF级小鼠购自武汉赛维尔生物科技有限公司,货号GA1003,动物生产许可证号为SCXK(沪)2019-0002。鼠龄6～8 w,平均体质量(23±3)g,采用笼养方式饲养,标准光照,饲料喂养,自由摄食,室温20～25 ℃,相对湿度45%～55%。适应性喂养1 w后进行实验。柠檬苦素(购自成都植标化纯生物技术有限公司,PCS0683,纯度95%)、环磷酰胺片(天津金世制药有限公司,18121001,规格50 mg)。

1.2细胞培养 MFC胃癌细胞解冻,加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基,1 500 r/min离心5 min,弃上清,沉淀,重悬,37 ℃、5%CO2孵育箱培养、传代。

1.3分组、造模、给药 50只SPF级小鼠随机分为模型组、阳性对照组及柠檬苦素低、中、高剂量组,每组10只。MFC胃癌细胞调整至1.5×106/ml。取0.2 ml细胞悬液接种于小鼠的右侧腋下,当瘤块直径达到0.5 cm时,表明造模成功〔13〕。模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠灌胃,阳性对照组给予环磷酰胺25 mg/kg灌胃,柠檬苦素低、中、高剂量组给予柠檬苦素12.5、25.0、50.0 mg/kg灌胃,灌胃体积均为20 ml/kg,1次/d,持续14 d。

1.4计算脾指数、胸腺指数及抑瘤率 末次给药后第2天,颈椎脱臼法处死小鼠,解剖其脾脏、胸腺及肿瘤组织,称重,计算脾指数、胸腺指数及抑瘤率。

1.5测定CD4+、CD8+T淋巴细胞百分数和CD4+/CD8+比值 取小鼠脾脏,加入适量磷酸盐缓冲液(PBS),轻撵磨碎,用200目筛网过滤,取混悬液用1 500 r/min离心5 min,适量PBS重悬细胞,制备脾淋巴细胞悬液,调整细胞密度为1×106/ml。取0.1 ml脾淋巴细胞悬液置于1.5 ml离心管,加CD4+、CD8+抗体(稀释度为1∶1 000),混匀,低温静置30 min;加PBS 1 ml,离心,弃上清;沉淀,加PBS 0.5 ml,后进行检测。

1.6检测白细胞介素(IL)-2、IL-10、干扰素(IFN)-γ的表达水平 摘眼球法取血,离心取血清,用酶标仪于450 nm处检测IL-2、IL-10、IFN-γ水平。

1.7检测胃癌组织中磷酸化(p)-STAT3、基质金属蛋白酶(MMP)-9的阳性表达率 末次给药后第2天,颈椎脱臼法处死小鼠,取部分胃癌组织,用 4%多聚甲醛固定进行组织石蜡包埋,对石蜡包埋标本的5 μm切片进行免疫组织化学染色,并用p-STAT3和MMP-9抗体进行染色,显微镜拍照。200倍显微镜下观察到胞核内有棕色颗粒者即为阳性细胞,每个样本随机选取10个视野,通过Image J软件进行细胞计数,计算阳性表达率。

1.8检测胃癌细胞中STAT3磷酸化水平 末次给药后第2天处死小鼠前,提取各组小鼠胃癌细胞,胰酶处理各组小鼠胃癌细胞,预冷PBS洗3遍,加预冷裂解缓冲液(RIPA)裂解细胞,静待30 min,离心15 min,取上清,进行二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量。 5×还原型上样缓冲液稀释混匀,沸水煮10 min,凝胶电泳,将蛋白转运到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h,加一抗稀释液4 ℃过夜,二抗室温孵育1～2 h,检测第705位点酪氨酸的磷酸化的STAT3蛋白(pTyr705-STAT3)、STAT3的表达,β-actin为内参。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1脾指数、胸腺指数及抑瘤率 与模型组相比,阳性对照组脾指数、胸腺指数显著降低(P<0.05),柠檬苦素低、中、高剂量组脾指数、胸腺指数显著升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组及柠檬苦素低、中、高剂量组抑瘤率均显著增加(P<0.05),见表1。

2.2CD4+、CD8+T细胞及其比值 与模型组相比,阳性对照组CD4+、CD8+T细胞及其比值显著下降(P<0.05);柠檬苦素低、中、高剂量组CD4+、CD8+T细胞及其比值显著上升(P<0.05),且组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3IL-2、IL-10、IFN-γ的阳性表达水平 与模型组相比,阳性对照组IL-2、IL-10水平显著下降,IFN-γ显著上升(P<0.05);而柠檬苦素低、中、高剂量组IL-2、IFN-γ水平显著增加,IL-10显著降低(P<0.05),且组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组脾指数、胸腺指数、抑瘤率、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IL-2、IL-10、IFN-γ比较

2.4各组胃癌组织中p-STAT3、MMP-9阳性表达率 与模型组相比,阳性对照组及柠檬苦素低、中、高剂量组p-STAT3、MMP-9的阳性表达率均显著下降(P<0.05),且柠檬苦素各剂量组两两比较差异有统计学意义(P<0.05),见表2、图1。

图1 各组胃癌组织中p-STAT3、MMP-9的阳性表达(免疫组织化学染色,×200)

2.5各组胃癌细胞中STAT3磷酸化水平 与模型组相比,阳性对照组及柠檬苦素低、中、高剂量组pTyr705-STAT3/STAT3水平均显著降低(P<0.05),且柠檬苦素各剂量组两两比较差异有统计学意义(P<0.05),见表2、图2。

表2 各组胃癌组织中p-STAT3、MMP-9的阳性表达率及STAT3磷酸化水平比较

1～5:模型组、阳性对照组、柠檬苦素低、中、高剂量组

3 讨 论

本研究中取MFC胃癌细胞悬液接种于小鼠的右侧腋下来构建胃癌小鼠模型,观察肿瘤直径,达0.5 cm时证实模型构建成功。对于动物而言,脾脏及胸腺是关键的免疫器官,本实验中常通过检测小鼠的脾指数及胸腺指数来判断实验小鼠的免疫器官功能是否发育良好、免疫细胞的状态是否正常及免疫状态是否稳定平衡〔14〕,因此,研究结果表明,柠檬苦素可以改善胃癌小鼠的免疫状态,提高免疫力,并且对胃癌还具有较好的抑制作用,呈现剂量依赖性,提示其可用于胃癌的治疗。环磷酰胺治疗肿瘤细胞的疗效较好但不良反应大、毒副作用强〔15〕,因此其在临床的使用受到了限制,本研究结果提示,柠檬苦素毒副作用小,具有较高的应用价值。

CD4+、CD8+T细胞与肿瘤免疫相关,癌症患者接受治疗后免疫功能得到改善,趋于平衡,体内CD4+、CD8+T细胞及其比值较治疗前升高〔16〕。本文提示,柠檬苦素对T淋巴细胞亚群具有调节性作用,其中阳性对照组所用环磷酰胺为免疫抑制剂类药物,会使CD4+、CD8+T淋巴细胞及其比值下降。IL-2是免疫因子,可以提高动物机体细胞免疫和体液免疫能力〔17〕,癌症患者常伴有细胞免疫功能损害,其标志性变化为IL-2表达下降。IL-10是免疫抑制因子,抑制免疫应答,参与肿瘤细胞周期调控、免疫逃逸、迁移等过程,与肿瘤的恶性程度和不良预后相关,在多种癌症患者体内呈现高表达〔18〕。IFN-γ与抗肿瘤免疫也有联系,其能够激活细胞免疫,杀伤肿瘤细胞〔19〕。本研究结果提示,柠檬苦素可调节免疫因子水平从而达到抑制肿瘤生长的作用。

STAT3是与癌细胞增殖和转移相关的致癌转录因子,MMP-9为STAT3下游靶基因,与为胃癌细胞的转移密切相关〔20〕。本研究通过免疫组化染色发现,柠檬苦素低、中、高剂量组中STAT3信号通路关键因子STAT3磷酸化水平及MMP-9阳性表达率均下降,降低了p-STAT3、MMP-9水平,抑制其激活,减弱了STAT3信号通路表达,抑制了癌症的发展。方明等〔21〕研究也提到STAT3、MMP-9的活化与乳腺癌的浸润和转移密切相关,与本文关于其与胃癌的研究相类似,提示柠檬苦素对于胃癌的治疗具有潜在价值。

综上,柠檬苦素能抑制胃癌小鼠模型肿瘤组织的发展,这与其提高小鼠免疫水平与抑制STAT3通路激活密切相关,为胃癌的临床治疗提供了新思路,但本文也有一定的局限性,一方面,本研究结论基于动物实验得出,是否适用于人体还需进一步实验佐证;另一方面,本研究仅基于STAT3信号通路进行研究,是否有其他信号通路参与尚不清楚,也需进一步实验证实。