基于铁死亡机制探究橘皮素对白内障模型大鼠眼晶状体的保护作用

张建成 李萍 胡海慈 吕自新 陈文生

(1南阳市第一人民医院眼科,河南 南阳 473000;2南阳市第二人民医院眼科)

白内障是导致失明的眼部疾病重要原因之一,其发病率与年龄密切相关,伴随年龄增长,其发病率呈上升态势〔1〕。目前,有关白内障治疗方法主要是通过手术摘除晶状体后采用人工晶状体替换,但是此方法容易导致角膜水肿和高眼压等副作用〔2〕。因此,积极寻找白内障有效的治疗方案及药物对于改善白内障患者临床症状具有重大意义。

白内障的主要病因与晶状体氧化应激〔3〕、炎症损伤〔4〕及细胞死亡〔5〕等相关。研究发现,铁死亡参与白内障的形成。铁死亡是一种铁依赖性细胞程序性细胞死亡方式,是以细胞内铁离子稳态被打破,进而导致活性氧及脂质过氧化产物增多,从而损害细胞内生物大分子,导致细胞死亡〔6〕。谷胱甘肽过氧物化酶(GPX)4是细胞内脂质过氧化反应的关键调节酶,GPX4表达降低会诱发活性氧产生增多,导致细胞脂质过氧化损伤,引起细胞铁死亡发生〔7〕。既往多项研究发现,白内障发病过程中晶状体上皮细胞中GPX4蛋白表达水平显著降低,细胞内氧化应激水平显著增加,且白内障患者铁过载可导致白内障形成加快〔8,9〕。因此阐明铁死亡与晶状体损伤的关系可以为白内障预防提供新的思路。橘皮素(TAN)是柑橘类果皮中最丰富的多甲氧基黄酮之一,具有广泛的药理活性。多项研究表明,TAN具有抗炎、抗氧化、调节代谢及神经保护等药理作用〔10,11〕。但有关TAN对白内障形成的影响尚不清楚。本研究基于铁死亡机制探究TAN对D-半乳糖诱导白内障模型大鼠晶状体的保护作用。

1 材料与方法

1.1动物 雄性SPF级Wistar大鼠60只,周龄6～8 w,平均体质量(200±10)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司〔SCXK(京)2020-0015〕,饲养于环境温度24～26 ℃,相对湿度(60±5)%,12 h昼夜交替光照。本实验经过医院医学伦理委员会审批(审查号:2021LLSC0003)。

1.2试剂 TAN(化合物纯度≥99.7%,Target Molecule公司);D-半乳糖(纯度≥99%,浙江一新制药股份有限公司);铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Med Chem Express公司,货号:HY-100579/CS-0019733);戊巴比妥钠(德国Merck公司,货号:4390-16-3);Fe2+检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号:20220014);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,货号:A001-3-2、A005-1-2、A003-1-2);转铁蛋白受体(TFR)1一抗、溶质载体家族7成员(SLC7A)11、GPX4一抗(碧云天生物技术,货号:AF8136、AF7992、AF7020)。

1.3仪器 裂隙灯显微镜(上海涵飞医疗器械有限公司,型号:YZ5G);酶标仪(山东莱恩德智能科技有限公司,型号:LD-96A);离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,型号:H-2050R-1);凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司,型号:Gel dox XR+);荧光倒置显微镜(日本/奥林巴斯Olympus,型号:CKX53)。

1.4白内障模型大鼠构建、分组及给药 依据参考文献〔1〕复制D-半乳糖诱导的白内障大鼠模型。50只Wistar大鼠适应性喂养1 w,随机选取40只大鼠于皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg),1次/d。另取10只大鼠为对照(control)组,给予等量生理盐水,其余操作相同。4 w后,在裂隙灯照射下观察大鼠晶状体浑浊程度,若晶状体出现浑浊则判定模型构建成功。将模型成功大鼠随机分为模型(model)组、TAN低剂量(TAN-L)组、TAN高剂量(TAN-H)组及铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)组各10只。TAN-L、H组分别以5、20 mg/kg的TAN灌胃给药〔12〕,1次/d。Ferrostatin-1组腹腔注射2 mg/kg Ferrostatin-1〔13〕,1次/d。Control组和model组腹腔注射等量生理盐水,1次/d。以上各组均连续给药4 w。

1.5白内障形成评估 给药干预4 w后,1%的戊巴比妥钠麻醉大鼠,采用0.5%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素混合滴眼液加入各组大鼠眼球进行散瞳,观察白内障形成及晶状体浑浊程度。

1.6组织病理学染色 将各组左眼晶状体组织磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后放置于4%的多聚甲醛溶液中固定,经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片(厚度约3 μm),之后进行苏木素-伊红(HE)染色观察组织病理学变化。

1.7晶状体浑浊程度评估 实验结束后,1%的戊巴比妥钠麻醉大鼠,采用0.5%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素混合滴眼液加入各组眼球进行散瞳,裂隙灯显微镜下观察晶状体浑浊程度。浑浊程度等级:0、1、2、3、4,等级越高表示晶状体浑浊程度越高。

1.8可溶性、不可溶性蛋白含量测定 依据参考文献〔14〕检测方法,采用蛋白质检测试剂盒对各组晶状体中可溶性蛋白和不可溶性蛋白含量进行测定。

1.9Fe2+、MDA含量及SOD、GSH-Px活性测定 依据检测试剂盒说明书,分别对各组大鼠晶状体中Fe2+、MDA含量及SOD、GSH-Px活性进行测定。

1.10Western印迹检测晶状体中TFR1、SLC7A11和GPX4蛋白表达 将晶状体组织匀浆裂解,离心后得到上清液,测定蛋白质浓度。之后按照每组蛋白上样量为30 μg,计算各自的上样体积;凝胶电泳约120 min,之后进行湿转转膜将目的蛋白从凝胶上转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%的脱脂牛奶进行封闭非特异性抗体,洗膜,每次3 min,共5次;4 ℃条件下,孵育对应一抗抗体(TFR1、SLC7A11、GPX4、β-actin,稀释比例为1∶1 000)16 h;磷酸盐缓冲溶液洗涤PVDF膜3次,每次5 min;室温条件下,孵育一抗抗体对应的二抗1 h;去除二抗,滴加显影液显影,最后对显影照片采用Image Pro Plus6.0软件进行蛋白相对表达定量。

1.11统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1TAN对白内障大鼠形成的形态学影响 control组晶状体结构清晰,清澈透明;model组晶状体出现典型的白内障,且晶状体浑浊程度等级显著增加,透明度明显降低。与model组相比,TAN-L、TAN-H、Ferrostatin-1组白内障严重程度明显减轻,且晶状体浑浊程度等级降低,透明度明显增加。与TAN-L组相比,TAN-H组白内障改善程度更为显著。见图1。

图1 TAN对D-半乳糖诱导大鼠白内障形成的影响

2.2TAN对白内障大鼠晶状体组织病理学的影响 control组晶状体组织结构完整,上皮细胞排列有序,无空泡。model组晶状体组织结构损坏严重,上皮细胞数目明显减少,排列紊乱,且晶状体后极出现大量空泡。与model组相比,TAN-L、TAN-H、Ferrostatin-1组晶状体病理性损伤得到明显改善,仅TAN-L组晶状体纤维化有轻微肿胀。与TAN-L组相比,TAN-H组晶状体组织损伤程度进一步减轻。见图2。

图2 各组晶状体组织病理学(HE染色,×200)

2.3TAN对白内障大鼠晶状体组织浑浊程度的影响 与control组相比,model组晶状体浑浊程度明显增加(P<0.05)。与model组相比,TAN-L、TAN-H和Ferrostatin-1组晶状体浑浊程度均明显降低(P<0.05)。与TAN-L组相比,TAN-H组晶状体浑浊程度明显降低(P<0.05)。见表1。

2.4TAN对白内障大鼠晶状体可溶性和不可溶性蛋白含量的影响 与control组相比,model组晶状体不可溶性蛋白含量明显增加,可溶性蛋白含量明显降低(P<0.05)。与model组相比,TAN-L、TAN-H和Ferrostatin-1组晶状体不可溶性蛋白含量明显降低,可溶性蛋白含量明显增加(P<0.05)。与TAN-L组相比,TAN-H组晶状体不可溶性蛋白含量明显降低,可溶性蛋白含量明显增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组晶状体浑浊程度及可溶性、不可溶性蛋白含量比较

2.5TAN对白内障大鼠氧化应激及Fe2+水平的影响 与control组相比,model组Fe2+、MDA水平明显升高,SOD、GSH-Px活性明显降低(P<0.05)。与model组相比,各干预组Fe2+、MDA水平明显降低,SOD、GSH-Px活性明显增强(P<0.05)。与TAN-L组相比,TAN-H组上述指标明显改善(P<0.05)。见表2。

2.6TAN对白内障大鼠提死亡相关蛋白表达的影响 与control组相比,model组TFR1蛋白表达明显升高,SLC7A11、GPX4蛋白表达明显降低(P<0.05)。与model组相比,各干预组TFR1蛋白表达明显降低,SLC7A11、GPX4蛋白表达明显升高(P<0.05)。与TAN-L组相比,TAN-H组上述蛋白表达明显改善(P<0.05)。见表2、图3。

表2 各组晶状体中Fe2+、MDA含量和SOD、GSH-Px活性及TFR1、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达比较

1～5:control组、model组、TAN-L组、TAN-H组、Ferrostatin-1组

3 讨 论

白内障是诱发失明的主要原因之一,与晶状体的氧化应激性损伤相关,主要表现为晶状体浑浊、视力障碍及光散射等。研究发现,全球范围内大约40%的失明患者是由白内障引起,且多发于老年人群,而氧化应激状态是导致白内障患者晶状体严重受损的重要机制〔15〕。因此,深入探究白内障晶状体损伤的病变机制并对其防治具有重要意义。本研究表明,白内障大鼠模型构建成功。TAN是从果实橘皮中提取得到的一种天然活性单体化合物,具有广泛的药理学作用〔16〕。

铁死亡是白内障晶状体损伤的新机制,主要是由于细胞内抗氧化系统的失衡,导致谷胱甘肽(GSH)合成不足及GPX4失活引发细胞脂质过氧化物代谢受阻〔17〕。在此基础上,细胞内不稳定铁池储存的大量Fe2+会释放至细胞内,并通过芬顿(Fenton)反应产生大量活性氧,促进脂质过氧化物产生增多,最终细胞膜机构改变,诱发细胞死亡〔18〕。本研究结果表明,TAN能够通过降低Fe2+水平,改善白内障大鼠晶状体损伤。铁死亡也被认为是一种氧化应激性损伤,MDA是纸质过氧化产物,氧化应激后受自由基影响而显著升高,其含量高低是反映细胞氧化应激损伤的关键指标〔19〕。SOD、GSH-Px是抗氧化性损伤关键调节酶〔20〕。既往研究证实,TFR1、SLC7A11和GPX4被认为是细胞铁死亡的关键调控蛋白。TFR1能够通过将细胞外Fe2+转运至细胞内,导致细胞铁超载,进而诱发Fenton反应,导致细胞发生脂质过氧化反应,诱导细胞死亡〔21〕。SLC7A11通过介导胱氨酸/谷氨酸转运系统合成GSH所需胱氨酸,而抑制SLC7A11表达后会显著抑制GSH生物合成,进而导致GPX4蛋白表达下调,抗氧化能力减低,并最终导致铁死亡发生〔22〕。多项研究已证实,铁死亡参与白内障形成,被认为是晶状体损伤的重要病理机制〔23,24〕。本研究结果表明,TAN能够通过抑制细胞铁死亡,进而减轻白内障大鼠晶状体损伤。Liu等〔25〕研究发现,脂多糖能够诱导人支气管上皮细胞铁死亡,给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理后能够逆转脂多糖诱导的人支气管上皮细胞铁死亡。本研究结果表明,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能够抑制白内障大鼠上述指标变化,改善晶状体损伤,从而发挥与TAN同向的保护效应。

综上,TAN能够改善白内障大鼠模型晶状体损伤,其机制与抑制细胞铁死亡相关。但本研究也存在一定的局限性,未在细胞层面上揭示TAN对晶状体损伤的影响。后续将通过体外培养晶状体上皮细胞,揭示TAN对氧化应激诱导晶状体上皮细胞铁死亡的影响。