银杏总黄酮对血管性痴呆大鼠神经元损伤的影响及作用机制

张棽 饶佳涛 王超越 李宏治

(湖北恩施学院 1教务处,湖北 恩施 445000;2医学部;3恩施州中心医院麻醉科)

血管性痴呆是威胁老年人健康并引发痴呆的主要原因之一〔1〕。缺血性脑卒中是引发血管性痴呆的常见病因,神经炎症反应、神经元自噬参与调控血管性痴呆的发生与发展〔2〕。相关研究显示,抑制神经炎症反应、增强神经元自噬作用能够改善血管性痴呆所致的认知障碍〔3〕。银杏是我国传统中药材,总黄酮是其主要活性成分〔4〕。相关研究显示,山楂总黄酮能够降低脑缺血大鼠炎性因子表达和神经细胞凋亡,保护神经系统功能〔5〕;但关于银杏总黄酮对神经细胞和神经系统影响的研究仍十分少见。本研究旨在探讨银杏总黄酮对血管性痴呆大鼠神经元损伤的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1动物与主要试剂 健康雄性SD大鼠,平均体质量(300±10)g,购于湖北省实验动物研究中心,许可证号:SCXK(鄂)2015-0018。饲养温度(24±1)℃,自由进食、进水,每日12 h光照。银杏总黄酮购于武汉普世达生物科技有限公司,货号20210605,质量分数≥98%。脑组织乙酰胆碱、5-羟色胺检测试剂盒购于武汉艾美捷科技有限公司;血清白细胞介素(IL)-1β、IL-17、IL-6检测试剂盒购于武汉赛培生物科技有限公司;鼠抗人Beclin1单克隆抗体,鼠抗人微管相关蛋白1轻链(LC)3单克隆抗体,鼠抗人PINK诱导激酶(PINK)1单克隆抗体,鼠抗人帕金蛋白(Parkin)单克隆抗体,鼠抗人β-actin单克隆抗体及二抗均购于武汉菲恩生物科技有限公司。

1.2血管性痴呆大鼠动物模型建立与分组 大鼠禁食、自由饮水12 h,麻醉后分离双侧颈总动脉并结扎。造模7 d后进行穿梭箱实验进行筛选,与正常大鼠相比步入潜伏期明显降低,暗室中花费的总时间明显升高提示血管性痴呆大鼠模型造模成功。随机分为模型组、50、100、200 mg/kg银杏总黄酮组,每组12只;另取12只大鼠为假手术组(仅分离双侧颈总动脉、不结扎)。各银杏总黄酮组灌胃给予相应剂量银杏总黄酮,另外两组给予等体积生理盐水,连续21 d。

1.3穿梭箱实验检测大鼠学习记忆能力 将各组大鼠放入照明状态腔室中,引导大鼠自由穿梭2个空腔室约10 min,当大鼠再次进入黑暗腔室时进行电击刺激(0.5 mA),至大鼠逃离到不通电的照明状态腔室中为止,记录大鼠进入黑暗腔室所需的时间(步入潜伏期)和暗室中花费的总时间。

1.4组织收集与处理 穿梭箱实验结束后麻醉大鼠,采集各组颈动脉血1.2 ml,3 000 r/min离心10 min,收集血清,-80 ℃保存。之后断头处死大鼠,取部分大脑组织加入RIPA裂解液,使用便携式组织匀浆机匀浆,12 000 r/min 4 ℃恒温离心20 min,收集上清,-80 ℃保存。另取部分大脑组织,常规石蜡包埋,切片后放于光学显微镜下观察,收集含有典型海马结构的脑组织切片,用于自噬相关蛋白和PINK1、Parkin蛋白表达检测。

1.5大鼠脑组织乙酰胆碱、5-羟色胺水平和血清炎症因子水平检测 取各组大鼠脑组织蛋白样品在冰水浴中解冻,吸取约0.2 ml脑组织蛋白样品,酶联免疫吸附试验测定脑组织乙酰胆碱、5-羟色胺浓度。取各组大鼠血清样品在冰水浴中解冻,吸取约0.3 ml血清,酶联免疫吸附试验测定血清IL-1β、IL-17、IL-6浓度。

1.6Western印迹检测大鼠海马组织中自噬相关蛋白和PINK1/Parkin信号通路蛋白表达 取各组含有典型海马组织结构的切片,脱蜡、水化后RIPA细胞裂解液提取总蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度,行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电转法将目标蛋白转膜,使用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液封闭1 h,滴加鼠抗人Beclin1单克隆抗体(稀释倍数1∶1 000),鼠抗人LC3单克隆抗体(稀释倍数1∶800),兔抗人PINK1单克隆抗体(稀释倍数1∶500),兔抗人Parkin单克隆抗体(稀释倍数1∶1 000),鼠抗人β-actin单克隆抗体(稀释倍数1∶2 000),4 ℃孵培育过夜,次日滴加羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG,稀释倍数1∶4 000,室温下1 h,电化学发光法(ECL)显影,使用ImageJ软件读取各条带灰度值。

1.7统计学分析 采用SPSS25.0统计学软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组海马组织自噬相关蛋白表达水平比较 模型组海马组织Beclin1蛋白、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白与假手术组相比升高,但差异无统计学意义(P>0.05);不同浓度银杏总黄酮组明显高于模型组和假手术组(P<0.05);随着银杏总黄酮浓度的增加自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平明显提升(P<0.05)。见图1,表1。

2.2各组学习记忆能力比较 模型组步入潜伏期明显低于假手术组,暗室中花费总时间明显长于假手术组(P<0.01);与模型组相比,不同浓度银杏总黄酮组步入潜伏期明显升高,暗室中花费总时间明显降低(P<0.05),随着银杏总黄酮浓度的增加上述改变逐渐明显(P<0.05)。见表1。

2.3各组海马组织PINK1、Parkin蛋白表达水平比较 模型组海马组织PINK1、Parkin蛋白与假手术组相比升高,但差异无统计学意义(P>0.05);不同浓度银杏总黄酮组明显高于模型组和假手术组(P<0.05);随着银杏总黄酮浓度的增加PINK1、Parkin蛋白表达水平明显提升(P<0.05)。见图1,表1。

1～5:假手术组、模型组、50、100、200 mg/kg银杏总黄酮组

表1 各组学习记忆能力及海马组织自噬相关蛋白、PINK1、Parkin蛋白表达水平比较

2.4各组脑组织乙酰胆碱、5-羟色胺水平比较 模型组脑组织乙酰胆碱、5-羟色胺水平明显低于假手术组(P<0.01);与模型组相比,不同浓度银杏总黄酮组明显升高(P<0.01),随着银杏总黄酮浓度的增加脑组织乙酰胆碱、5-羟色胺水平明显升高(P<0.01)。见表2。

2.5各组血清IL-1β、IL-17、IL-6水平比较 模型组血清IL-1β、IL-17、IL-6水平明显高于假手术组(P<0.01);与模型组相比,不同浓度银杏总黄酮组明显降低(P<0.01),随着银杏总黄酮浓度的增加血清IL-1β、IL-17、IL-6水平明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组脑组织乙酰胆碱、5-羟色胺、IL-1β、IL-17、IL-6水平比较

3 讨 论

随着我国人口老龄化进程的发展,血管性痴呆患病率呈逐年上升趋势,生活自理能力明显下降,增加了家庭和社会的经济、医疗负担〔6〕。本实验结果提示,大鼠学习记忆受损,出现认知障碍,血管性痴呆大鼠模型造模成功;银杏总黄酮能够改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力,减轻认知障碍程度。血清炎性因子升高所致的神经炎症反应扩大会加重海马神经元损伤,降低5-羟色胺、乙酰胆碱水平,导致学习记忆能力减退〔7〕。

脑灌注不足所致的异常炎症反应是血管性痴呆的主要病理基础〔8〕,自噬作用也参与其中,加强自噬作用能够保护神经元,是血管性痴呆治疗的主要手段〔9〕。银杏是我国传统中药材,具有活血化瘀、活血通络等功效〔10〕。研究发现,锦鸡儿总黄酮是其主要活性成分,能够减轻脑缺血再灌注损伤〔11〕。本研究结果提示,模型组大鼠神经元自噬代偿性升高幅度难以对抗神经元损伤,导致血管性痴呆的发生;另外,提示银杏总黄酮可通过提高自噬相关蛋白表达来加强神经元自噬,减轻海马神经元损伤,达到改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力的目的。

PINK1/Parkin信号通路参与调控阿尔茨海默病的病理过程,其中PINK1、Parkin表达上调能够增强神经元的自噬代偿能力,加速清除受损线粒体,保护神经细胞免受氧化应激损伤〔12〕。PINK1表达上调还能够激活神经元自噬信号,减轻神经元损伤,进而发挥对阿尔茨海默病的治疗作用〔13〕。本研究结果提示,银杏总黄酮可通过激活PINK1/Parkin信号通路,提高自噬作用,减轻神经元损伤,最终达到改善血管性痴呆症状的作用。