蒙药协日嘎-4汤对糖尿病肾病大鼠肾保护作用及肾组织单核细胞趋化蛋白-1表达

刘萨仁 佟玉清 玉晓 张春花

(内蒙古民族大学附属医院蒙医内分泌科,内蒙古 通辽 028000)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症,导致终末期肾衰竭和糖尿病病死率增加的重要因素,该病治疗费用高且难度大。因此采取有效措施治疗DN,具有重要的临床意义。DN发病机制复杂多样,炎症因子在DN发病机制中起至关重要作用〔1〕。协日嘎-4汤是具有抗炎作用的传统蒙药制剂,本研究旨在观察蒙药协日嘎-4汤对DN大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、C反应蛋白(CRP)含量及肾组织单核细胞趋化因子(MCP)-1表达的影响,探讨蒙药协日嘎-4汤对DN肾保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 Wistar大鼠雄性,体质量(200±10)g,8周龄,购自辽宁长生生物技术有限公司,许可证号:SCXX(辽)2015-0001。

1.2实验仪器 BS-200迈瑞全自动生化分析仪(深圳市永利鑫科技有限公司),罗氏卓越型血糖仪(上海三葳医疗设备有限公司),DW-GL218低温冰箱,电子天平(AUY120日本岛津),PCRYD-202AIII型冷冻切片机(河南郑州南北仪器有限公司),DW-GL218低温冰箱(上海能共实业有限公司),CKX-RFA荧光显微镜(上海普赫光电科技有限公司)。

1.3实验药物 链脲佐菌素(S17049-5 g,上海源叶生物技术有限公司)。蒙药协日嘎-4汤(准字号:20180704,由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室)。依那普利片(准字号:H20083534,上海新亚药业闵行有限公司)。0.05 ml/L pH4.4枸橼酸盐缓冲液(批准字号:R22479-500 ml,上海源叶生物技术有限公司)。尿蛋白酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海仁捷生物科技有限公司)。大鼠肾功能ELISA试剂盒(南京搏尔塞生物科技有限公司)。炎症因子ELISA试剂盒(上海沪震实业有限公司)。

1.4动物模型制备 60只大鼠适应性喂养1 w后,随机选10只大鼠作为正常对照组用普通饲料喂养,其余50只高脂饲料喂养4 w,在空腹10 h状态下腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg,72 h后尾静脉取血,连续2次检查血糖均>16.7 mmol/L为糖尿病模型复制成功,继续高脂饲料喂养2 w后连续2次检查尿微量白蛋白30 mg/24 h以上时即为DN模型成功。

1.5分组及给药方法 将造模成功的50只鼠随机分为5组:模型组、阳性对照组、协日嘎-4汤低、中和高剂量组。阳性对照组给予依那普利1.5 mg/(kg·d)灌胃,蒙药协日嘎-4汤低、中、高剂量组分别给予协日嘎-4汤0.45、0.90、1.80 g/(kg·d)灌胃,正常对照组和模型组分别给予同等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续灌胃给药8 w。实验期间大鼠自由进食和饮水。每日测量1次大鼠尾静脉血糖,如果血糖大于24 mmol/L时给予皮下注射长效胰岛素1～2 U,避免发生糖尿病急性并发症而死亡。

1.6检测指标 治疗8 w末次给药后用代谢笼收集24 h尿液,记录总尿量、监测尿蛋白,各组均用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉,取腹主动脉血,全自动生化分析仪检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr),ELISA测定血清TNF-α、IL-6、CRP含量。苏木素-伊红(HE)染色法观察肾组织病理学变化。免疫组化(SP)法检测MCP-1蛋白表达。

1.7统计学分析 采用SPSS17.0软件进行方差分析、t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1各组24 h尿蛋白、血清BUN、Scr比较 与正常对照组比较,模型组24 h尿蛋白定量及血清BUN、Scr水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,各治疗组24 h尿蛋白及血清BUN、Scr均明显降低(P<0.05,P<0.01)。见表1。

2.2各组血糖比较 与正常对照组比较,模型组空腹血糖(FBS)明显升高(P<0.01)。见表1。

表1 各组24 h尿蛋白定量及血清BUN、Scr的比较

2.3各组血清炎症因子TNF-α、IL-6 、CRP比较 与正常对照组比较,模型组血清炎症因子TNF-α、IL-6、CRP含量均明显升高(P<0.01);与模型组比较,各治疗组血清炎症因子TNF-α、IL-6、CRP含量明显下降(P<0.05,P<0.01)。见表2。

表2 各组血清TNF-α、IL-6、CRP含量比较

2.4各组肾组织病理变化比较 正常对照组肾小球结构清晰,形态正常,肾小管结构清晰无管型;模型组肾小管可见上皮细胞较多空泡变性,肾小管管腔可见蛋白管型和细胞管型,肾小球基底膜增厚、系膜增生改变。阳性对照组部分肾小管可见上皮细胞空泡变性及肾小球基底膜增厚、系膜增生改变。协日嘎-4汤低剂量组较多肾小管可见上皮细胞空泡变性及肾小球基底膜增厚,系膜增生改变。协日嘎-4汤中剂量组部分肾小管可见上皮细胞空化空泡变性及肾小球基底膜增厚、系膜增生改变。协日嘎-4汤高剂量组偶见肾小管上皮细胞空泡变性及肾小球基底膜增厚、系膜增生改变。肾脏损伤程度由重到轻依次为模型>低剂量组>中剂量组>阳性对照组>高剂量组。见图1。

图1 各组肾组织病理(HE染色,×400)

2.5各组肾组织MCP-1表达比较 5组肾组织MCP-1表达差异有统计学意义(n=5,F=7.632,P<0.01);正常对照组肾组织MCP-1表达(0.16±0.01)极少,与模型组(0.46±0.06)比较,阳性对照组、协日嘎-4汤低、中、高剂量组肾组织MCP-1表达显著降低(0.26±0.05、0.28±0.05、0.25±0.05、0.22±0.02,P<0.05,P<0.01)。见图2。

图2 各组肾组织MCP-1表达(SP,×400)

3 讨 论

DN的发生涉及多种因素,如遗传因子、肾小球超滤、氧化应激、晚期糖基化终末产物蓄积、蛋白激酶C活化、多元醇通路激活、细胞因子及炎症反应等〔2〕。近年来,许多实验和临床研究〔3～5〕均证实,炎症在DN发病机制中的关键作用,高血糖、非酶糖化与晚期糖基化终末产物的生成、血管紧张素-Ⅱ、氧化应激反应等激活肾脏局部的炎症细胞,活化的炎症细胞及其释放的各种炎症因子如TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1等引起细胞膜脂质过氧化,导致肾血管收缩和肾组织损伤。MCP-1通过刺激炎症介质IL-1,IL-6、TNF-α释放,产生氧自由基,发生炎症反应,促进肾小管上皮细胞变性坏死、肾小球系膜细胞增生增殖,加速肾小球硬化,从而促进DN的发生发展〔6〕。

蒙药协日嘎-4汤是古籍文献所记载的传统蒙药方剂,广泛应用于防治肾脏、膀胱和尿路疾病等。具有抑菌、抗炎、免疫调节、利尿、镇痛作用〔7〕。临床研究发现协日嘎-4汤具有降低DN患者24 h尿微量白蛋白及改善肾功能作用〔8〕。协日嘎-4汤由姜黄、黄柏、蒺藜、栀子四味药组成。现代药理学研究证实黄柏具有降血糖、抗炎、解热、抗氧化作用〔9〕。姜黄主要成分姜黄素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎抗菌、降血糖等药理作用。其抗炎作用可能是与抑制NF-κB信号通路,减少TNF-α的分泌有关〔10～12〕。刘毅等〔13〕通过姜黄素对慢性不可预知性刺激诱发小鼠肾损伤的保护作用及机制研究,证实姜黄素具有降低炎性浸润,保护肾功能作用。栀子苷也具有抗炎、抗氧化、降血脂和降血糖等多种药理活性,尤其通过降低IL-1β、TNF-α水平,减少炎症递质和炎症因子的产生,调节多种信号通路发挥抗感染和免疫调节作用〔14〕。

本研究结果提示,协日嘎-4味汤能延缓DN大鼠肾脏损伤进展,具有肾保护作用,其机制可能与协日嘎-4汤通过下调肾组织MCP-1的表达来减轻糖尿病肾病的炎症状态有关。协日嘎-4汤通过哪些途径下调MCP-1表达的作用机制,还有待探索。