灵芝提取物通过miR-143-3p对Aβ25～35诱导的神经细胞损伤的影响

马玲 钟利国 崔裕如 刘彬

(荆州市第一人民医院 1中医科,湖北 荆州 434000;2科研科)

阿尔茨海默病(AD)是一种中枢神经系统退行性疾病,其发病机制较为隐匿,神经细胞凋亡、大脑皮层等形成神经纤维缠结是AD的主要病理特征〔1〕。β淀粉样蛋白 (Aβ)25～35聚集与沉积可促进神经细胞凋亡从而促进AD的发生〔2〕。研究表明,部分中药的活性成分或提取物具有抗炎、抗氧化等作用,并可用于治疗AD〔3,4〕。灵芝可减缓AD患者神经退行性疾病,并可改善患者的非运动症状,研究表明,灵芝提取物可减轻1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的神经细胞损伤〔5〕。但灵芝提取物与Aβ25～35诱导的神经细胞损伤的相关研究尚未见报道。miR-143-3p在AD细胞模型中表达水平升高,抑制其表达可促进神经细胞存活〔6〕。本研究通过Aβ25～35诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12建立AD细胞模型,探讨灵芝提取物通过调控miR-143-3p表达对Aβ25～35诱导的PC12细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 西安瑞仁生物技术有限公司提供灵芝提取物;上海弘顺生物科技有限公司提供大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12;美国Invitrogen提供LipofectamineTM3000转染试剂;北京天根生化科技有限公司提供miRNA提取试剂盒、反转录试剂盒及SYBR Green试剂盒;北京索莱宝提供噻唑蓝(MTT)试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒;南京建成生物工程研究所提供丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒;武汉艾美捷提供兔抗鼠酶切的胱天蛋白酶(Cleaved-caspase)3、Cleaved-caspase9抗体购自;美国Santa Cruz提供内参GAPDH抗体与二抗。

1.2实验分组 PC12细胞接种于96孔板,用20 μmol/L的Aβ25～35处理PC12细胞24 h〔7〕建立AD细胞模型(Aβ25～35组),control组为未经Aβ25～35处理细胞;分别加入含有不同浓度(0.1、1.0、10.0 mg/L)灵芝提取物〔8〕与20 μmol/L Aβ25～35的DMEM培养基培养24 h,分别记为Aβ25～35+GLE-L组、Aβ25～35+GLE-M组、Aβ25～35+GLE-H组。另设置Aβ25～35+anti-miR-NC 组(转染anti-miR-NC后,用20 μmol/L的Aβ25～35处理PC12细胞24 h)、Aβ25～35+anti-miR-143-3p 组(转染anti-miR-143-3p后,用20 μmol/L的Aβ25～35处理PC12细胞24 h);参照LipofectamineTM3000转染试剂说明书将miR-NC、miR-143-3p mimics分别转染至PC12细胞,转染成功后加入含有浓度为10 mg/L灵芝提取物与20 μmol/L Aβ25～35的DMEM培养基培养24 h,分别记为Aβ25～35+GLE+miR-NC组、Aβ25～35+GLE+miR-143-3p组。

1.3MTT检测 PC12细胞接种在96孔板中,按1.2法处理细胞,培养2 d后,每孔中加入20 μl MTT试剂,继续反应4 h倒掉培养液,每孔中加150 μl 二甲基亚砜(DMSO)试剂,于酶标仪490 nm处检测吸光度(OD)值。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞,加入1×结合缓冲液将细胞重悬,加膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI)试剂5 μl,避光反应15 min,上流式细胞仪检测。

1.5MDA含量和SOD、CAT活性检测 取各组PC12细胞,裂解后取上清液,检测MDA含量、SOD和CAT活性。

1.6实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-143-3p表达水平 采用miRNA提取试剂盒分别提取PC12细胞总RNA,反转录合成cDNA,以cDNA为模板进行RT-qPCR扩增,应用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪检测miR-143-3p相对表达量。

1.7Western印迹检测Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达 提取各组PC12细胞总蛋白,取30 μg蛋白经Cleaved-caspase3(1∶1 000)、Cleaved-caspase9(1∶1 000)电泳分离、转膜、封闭后,与GAPDH抗体(1∶2 000)4 ℃孵育24 h,再与二抗稀释液(1∶3 000)37 ℃孵育2 h,分析条带灰度值。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1灵芝提取物对Aβ25～35诱导的PC12细胞增殖、凋亡的影响 与control组比较,Aβ25～35组细胞活力明显降低,细胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达明显升高(P<0.05);与Aβ25～35组比较,Aβ25～35+GLE-L组、Aβ25～35+GLE-M组、Aβ25～35+GLE-H组细胞活力明显升高,细胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达明显降低,且呈剂量依赖性(P<0.05),见图1、图2、表1。

1～9:control组、Aβ25～35组、Aβ25～35+GLE-L组、Aβ25～35+GLE-M组、Aβ25～35+GLE-H组、Aβ25～35+anti-miR-NC组、Aβ25～35+anti-miR-143-3p组、Aβ25～35+GLE+miR-NC组、Aβ25～35+GLE+miR-143-3p组

图2 灵芝提取物对PC12细胞凋亡的影响

2.2灵各组PC12细胞中MDA水平及SOD、CAT活性比较 与control组比较,Aβ25～35组MDA水平明显升高,SOD、CAT活性明显降低(P<0.05);与Aβ25～35组比较,Aβ25～35+GLE-L组、Aβ25～35+GLE-M组、Aβ25～35+GLE-H组MDA水平明显降低,SOD、CAT活性明显升高,且呈剂量依赖性(P<0.05),见表1。

2.3各组PC12细胞中miR-143-3p表达比较 与control组比较,Aβ25～35组miR-143-3p表达量明显升高(P<0.05);与Aβ25～35组比较,Aβ25～35+GLE-L组、Aβ25～35+GLE-M组、Aβ25～35+GLE-H组miR-143-3p的表达量明显降低,且呈剂量依赖性(P<0.05),见表1。

表1 灵芝提取物对PC12细胞增殖、凋亡和细胞中MDA含量、SOD、CAT活性及miR-143-3p表达的影响

2.4过表达或抑制miR-143-3p转染效率 与miR-NC组(1.00±0.04)比较,miR-143-3p组miR-143-3p表达量(2.29±0.17)显著升高(t=22.160,P<0.05);与anti-miR-NC组(0.98±0.08)比较,anti-miR-143-3p组miR-143-3p表达量(0.39±0.06)明显降低(t=17.700,P<0.05)。

2.5抑制miR-143-3p对Aβ25～35诱导的PC12细胞增殖、凋亡、MDA含量及SOD、CAT活性的影响 与Aβ25～35+anti-miR-NC组比较,Aβ25～35+anti-miR-143-3p组细胞活力明显升高,细胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达、MDA水平明显降低,SOD、CAT活性明显升高(P<0.05),见图1、图3、表2。

图3 抑制miR-143-3p对PC12细胞凋亡的影响

表2 抑制miR-143-3p对PC12细胞增殖、凋亡、MDA含量、SOD、CAT活性的影响

2.6miR-143-3p对灵芝提取物处理的Aβ25～35诱导的PC12细胞增殖、凋亡、MDA含量、SOD、CAT活性的影响 与Aβ25～35+GLE+miR-NC组比较,Aβ25～35+GLE+miR-143-3p组细胞活力明显降低,细胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表达MDA水平明显升高,SOD、CAT活性明显降低(P<0.05),见图1、表3、图4。

表3 miR-143-3p对灵芝提取物处理的PC12细胞增殖、凋亡、MDA含量、SOD、CAT活性的影响

图4 miR-143-3p对灵芝提取物处理的PC12细胞凋亡的影响

3 讨 论

miRNA在AD细胞模型中表达异常,为AD的潜在治疗靶点〔9,10〕。灵芝提取物可通过抗氧化作用,减轻角质形成细胞和MPP+诱导的神经元损伤〔11,12〕。灵芝提取物可减轻缺氧诱导的神经细胞损伤〔13〕。本研究结果与既往研究报道结果相似〔14,15〕,提示灵芝提取物可抑制Aβ25～35诱导的PC12细胞氧化应激。

缺糖缺氧诱导的脑微血管内皮细胞中miR-143-3p表达水平升高〔16〕。miR-143-3p表达下调可减轻缺血性脑卒中损伤并保护星形胶质细胞〔17〕。抑制miR-143-3p表达可减轻脑缺血/再灌注损伤〔18〕。本研究结果显示,灵芝提取物可能通过抑制miR-143-3p表达而减轻Aβ25～35诱导的PC12细胞损伤,抑制miR-143-3p表达可促进Aβ25～35诱导的PC12细胞增殖及抑制细胞凋亡、氧化应激,而miR-143-3p过表达可减弱灵芝提取物对Aβ25～35诱导的PC12细胞损伤的作用。

综上,灵芝提取物可通过抑制miR-143-3p表达而促进Aβ25～35诱导的PC12细胞增殖及抑制细胞凋亡、氧化应激从而减轻细胞损伤,miR-143-3p可能作为灵芝提取物治疗AD的潜在靶点。