克洛己新干混悬剂对LPS诱导支气管上皮细胞炎症反应的作用

冯剑 朱宝 冯娜

(新郑华信民生医院呼吸内科,河南 新郑 100022)

肺部疾病最常见的为慢性阻塞性肺疾病、哮喘和肺癌〔1〕。在肺组织中,支气管上皮充当防御屏障保护其正常功能〔2〕。一旦支气管上皮被外部刺激物激活,可能会产生活性氧自由基(ROS),导致肺部炎症和肺组织损伤。此外,气道炎症可导致气道上皮细胞的损伤和功能障碍,从而加重呼吸道疾病的发病机制和进展〔3〕。研究表明,气道疾病模型中的上皮细胞凋亡和炎症因子释放是促进气道疾病发生发展的重要原因〔4〕。脂多糖(LPS)是革兰阴性菌的主要膜成分,对呼吸道细胞具有极高的毒性,并是一种有效的促炎活性诱导剂〔3〕。已知支气管上皮细胞的激活与肺部疾病的许多方面有关〔5〕,肺支气管上皮细胞对病原体的识别在LPS诱导的肺部炎症中起重要作用。Toll样受体(TLR)-4作为一种具有识别功能的受体,可结合下游丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核转录因子(NF)-κB〔6〕。活化的MAPK和NF-κB可通过促进肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β及其他促炎细胞因子的表达来调节炎症〔7〕。既往研究发现,头孢类药物、噻托溴铵等药物可减轻支气管上皮细胞的炎症反应〔8,9〕。克洛己新干混悬剂由盐酸溴己新和头孢克洛合成,具有抗感染、抗菌等治疗作用〔10〕,现已广泛应用于临床。然而,目前尚无证据支持其在LPS诱导支气管上皮细胞炎症反应中的保护作用。本研究利用人支气管上皮细胞系BEAS-2B,从细胞层面探究克洛己新干混悬剂对LPS诱导支气管上皮细胞炎症损伤中的作用及其可能机制。

1 资料与方法

1.1一般材料 人支气管上皮细胞系BEAS-2B购自上海富恒生物科技有限公司,LPS购自美国Sigma-Aldrich公司。克洛己新干混悬剂购自江苏正大清江制药有限公司。CCK-8检测试剂盒、凋亡检测试剂盒分别购自日本Dojindo公司及美国Invitrogen公司。一级抗体TLR4、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65及其对应二抗均购自美国Cell signaling technology公司。Western蛋白印迹实验相关耗材包括RIPA蛋白提取试剂、封闭液、一抗及二抗稀释液、化学发光显影液均购自中国上海碧云天生物技术有限公司。

1.2细胞分组处理 实验分为对照组(无干预)、LPS组(给予25 μg/ml LPS)、克洛己新干混悬剂组(给予1 mg/ml克洛己新干混悬剂)和LPS+克洛己新干混悬剂组(分别给予25 μg/ml LPS和1 mg/ml克洛己新干混悬剂)〔11〕。

1.3CCK-8法检测细胞活性 将细胞以104个/孔的密度接种于96孔板中,按照分组进行相应操作后,每孔加入10 μl CCK-8试剂,放回培养箱继续孵育3 h,放入分光光度计测定450 nm处吸光度(OD)值,计算各组细胞相对活性。

1.4膜联蛋白Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ/PI)双染色流式细胞仪测定细胞凋亡情况 将细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板中,按照分组进行相应操作后,按照试剂盒说明书,用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次,1 000 r/min离心10 min留取细胞沉淀,加入500 μl结合缓冲液,依次加入10 μl Annexin V和5 μl PI染液后,室温、避光孵育15 min后,将细胞样品置入流式细胞仪中检测细胞凋亡率。

1.5Western印迹法检测蛋白表达水平 将细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板中,按照分组进行相应操作后,用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次,加入RIPA细胞裂解液,在冰上裂解细胞30 min,4 ℃、12 000 r/min离心20 min提取上清液,使用蛋白浓度测定试剂盒测定样品中的蛋白浓度。经凝胶电泳分离蛋白,转膜、封闭、孵育相应一抗,次日室温下进行二抗孵育,洗膜,化学发光液加于膜上,在荧光成像系统中进行蛋白条带荧光成像。后使用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值,β-actin作为内参蛋白。

1.6DCFH-DA 法检测细胞内ROS水平 将细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板中,按照分组进行相应操作后,收集细胞后用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍,加入 5 μmol/L DCFH-DA于37 ℃ 培养箱中避光孵育30 min,后用PBS冲洗细胞3遍。根据说明书指示,将细胞放入荧光酶标仪中,设置激发波长为485 nm,发射波长为530 nm,测定细胞荧光强度。计算荧光相对值,值越大提示ROS含量越高。

1.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞中TNF-α及IL-1β蛋白水平 将细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板中,按照分组进行相应操作后,收集细胞培养液,离心取上清后根据说明书测定蛋白表达水平,采用分光光度计测定450 nm处OD值,绘制标准曲线,计算蛋白浓度。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件行t检验。

2 结 果

2.1各组细胞活性及凋亡情况比较 与对照组相比,LPS组和LPS+克洛己新干混悬剂组细胞活性显著降低(t=11.71、5.51,均P<0.05);与LPS组相比,LPS+克洛己新干混悬剂处理可显著增加细胞活性(t=11.02,P<0.05)。与对照组相比,LPS组和LPS+克洛己新干混悬剂组细胞凋亡率明显增高(t=25.62、13.09,均P<0.05);与LPS组相比,LPS+克洛己新干混悬剂处理可显著降低细胞凋亡率(t=11.69,P<0.05)。见表1。

2.2各组细胞ROS、TNF-α及IL-1β水平比较 与对照组相比,LPS组和LPS+克洛己新干混悬剂组细胞ROS水平显著升高(t=18.00、6.92,均P<0.05);与LPS组相比,LPS+克洛己新干混悬剂处理可显著降低细胞ROS水平(t=8.05,P<0.05)。此外,与对照组比较,LPS组及LPS+克洛己新干混悬剂组TNF-α(t=14.31、13.83,均P<0.05)及IL-1β水平(t=14.84、4.49,均P<0.05)显著升高。相反,克洛己新干混悬剂可逆转LPS引起的炎症反应,显著下调TNF-α和IL-1β水平(t=6.89、8.93,均P<0.05),见表1。

表1 各组细胞活性及凋亡率、细胞ROS、TNF-α、IL-1β水平比较

2.3各组细胞TLR4/MAPK/NF-κB信号通路激活情况 与对照组相比,LPS组TLR4、MAPK、NF-κB蛋白表达明显增加(t=11.92、15.43、15.00,均P<0.05),提示该通路被激活。此外,LPS+克洛己新干混悬剂组TLR4/MAPK/NF-κB信号通路也有一定程度活化(t=4.38、7.70、8.13,均P<0.05)。与LPS组比较,LPS+克洛己新干混悬剂组TLR4、MAPK、NF-κB蛋白均显著降低(t=9.62、5.22、8.11,均P<0.05),提示尽管LPS可以使该通路活化,但克洛己新干混悬剂治疗可抑制其活化,见表2。

表2 各组细胞TLR4/MAPK/NF-κB信号通路活化情况

3 讨 论

克洛己新干混悬剂作为一种复合制剂药物,包含头孢克洛和盐酸溴己新,目前临床上多用于抗感染、止咳化痰等治疗目的。既往关于克洛己新干混悬剂的研究多聚焦于临床应用。李燕梅等〔11〕发现,该药物在治疗小儿慢性咳嗽方面的效果显著,可有效缓解咳嗽症状及炎症反应;此外,使用克洛己新干混悬剂可有效减轻铜绿假单胞菌诱发PA肺炎小鼠的肺损伤情况,还可抑制小鼠血清炎症因子表达〔12〕。

本研究发现,LPS可显著诱导支气管上皮细胞活性降低,诱导凋亡反应的发生,与Liu等〔5〕及Lv等〔13〕的研究结果相一致。当同时给予克洛己新干混悬剂治疗,可明显逆转上述变化,增加细胞活性及抑制凋亡反应的发生。此外,本研究还发现,LPS可明显增加支气管上皮细胞的ROS、TNF-α及IL-1β水平,还首次发现当同时使用克洛己新干混悬剂干预可显著降低上述因子水平,提示克洛己新干混悬剂治疗可减轻由LPS引起的支气管上皮细胞损伤及炎症反应,从而达到保护细胞的目的。

在其机制研究方面,已知TLR-4/MAPK/NF-κB信号通路在LPS诱导肺损伤中扮演重要角色〔14,15〕。如Tao等〔14〕发现,罗汉果中的活性成分通过下调TLR-4/MAPK/NF-κB信号通路,在LPS诱导的急性肺损伤炎症反应中发挥关键作用。本研究发现,LPS诱导了支气管上皮细胞中TLR-4/MAPK/NF-κB通路的激活,而同时给予克洛己新干混悬剂治疗时,上述信号通路活性被显著抑制,具体表现为TLR-4蛋白表达减少,MAPK及NF-κB的磷酸化水平降低。该发现为克洛己新干混悬剂在LPS诱导肺支气管上皮细胞中的抗炎作用提供了进一步的理论支持。

综上,克洛己新干混悬剂可通过抑制由LPS引起的人肺支气管上皮细胞活性降低、凋亡反应增加、氧化应激标志物ROS及细胞炎症因子TNF-α及IL-1β的水平,此外还可抑制TLR-4/MAPK/NF-κB通路的激活,从而发挥保护性作用。上述发现为治疗由LPS引起的肺损伤提供了新思路及理论依据。