HMGN5基因与子宫内膜癌临床病理特征及生物学行为的关系

郑雪群 李文怡 兰丽芳

(柳州市人民医院妇科,广西 柳州 545000)

子宫内膜癌是常见的女性恶性肿瘤疾病,具有较高的发病率,预后较差〔1,2〕。子宫内膜癌患者复发率高和预后差主要是由于肿瘤细胞的侵袭和转移〔3〕。近期,高迁移率族核小体结合域(HMGN)5成为研究热点,研究发现HMGN5蛋白在前列腺癌、膀胱癌及乳腺癌中均有较高的表达,而且与神经胶质瘤及胃肠道肿瘤大发生发展相关,但是针对HMGN5与子宫内膜癌患者的相关性及与癌细胞侵袭转移相关性研究较少〔4,5〕。本研究分析HMGN5基因在不同临床特征下表达差异及其对肿瘤细胞生物学行为的影响。

1 资料与方法

1.1基本资料 选择柳州市人民医院2020年1月到2021年6月收治的子宫内膜癌患者79例,均进行根治性切除术,患者年龄平均(54.8±9.2)岁,其中存在淋巴转移患者14例,高、中、低分化患者分别有40、25、14例,国际妇产科学联合会(FIGO)分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分别有45、16、12、6例。

患者纳入标准:(1)均经过组织病理诊断;(2)术前均没有接受过放化疗治疗。排除标准:(1)重要器官严重障碍;(2)精神障碍;(3)同时患有其他类型肿瘤;(4)临床资料不全。本研究已获得伦理审批;患者或其家属均已自愿签订知情同意书。

1.2试剂和仪器 胎牛血清(批号:1907128)、胰蛋白酶(批号:1978483)、DMEM培养基(批号:8119335)由美国Sigma公司提供,人子宫内膜癌HEC-1A细胞由科院上海生物细胞库提供,Trizol试剂盒(批号,20191108)购自美国Invitrogen公司,聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(批号:20181106)和反转录(RT)试剂盒(批号:18021803)购自日本TaKaRa公司,β-actin(批号:18120736)和HMGN5(批号:19208371)由上海生工生物工程股份有限公司提供,HMGN5对照序列(批号:19-W-190932)和干扰序列(19-W-191023)由上海瑞赛生物技术公司提供,CCK-8试剂盒(批号:19111863)由美国Promega公司提供,基质胶(批号:19091284)和Transwell小室(批号:12319042)由美国BD公司提供。

1.3HMGN5 mRNA表达量检测 取子宫内膜癌组织及癌旁组织,匀浆、裂解、离心处理后,提取总RNA,而后按照试剂盒说明反转录cDNA,应用RT-PCR法测定HMGN5 mRNA的表达情况(相对量)。反应体系配制:10 mmol/L的上下游引物0.5 μl(HMGN5上游引物:5′-TACAACAATGCC-CAAAAGAAAGGCT-3′,下游5′-TGTAACTGGCACAAGCATAGCAGA-3′;β-actin上游引物:5′-CCACACCTTCTACAATGAGC-3′,下游5′-TGAGGTAGTC-AGTCAGGTCC-3′)。加入含SYBR Green Ⅰ (12.5 μl),cDNA(0.5 μl),RoxⅡ(0.5 μl)及灭菌水(11.0 μl)的混合溶液中。扩增循环参数设置:3 min 95 ℃,15 s 95 ℃,30 s 58 ℃,30 s 73 ℃,共进行38个循环,10 min 72 ℃。应用2-△△Ct法计算HMGN5 mRNA相对表达量。

1.4细胞培养 HEC-1A细胞复苏后在10%胎牛血清DMEM培养集中进行培养。培养环境为37 ℃,5%CO2饱和湿度培养箱,待细胞长至80%～90%时用胰酶消化进行传代。取对数期细胞随机将其分为HMGN5促进组〔转染NMGN5干扰序列(正义链:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反义链5′-ACGUGACACGUUCGGACAATT-3′)〕、HMGN5正常组〔转染HMGN5干扰对照序列(正义链5′-CACAGCCTTTCTTTAGCATTT-3′,反义链5′-GTGTCGGAAAGAAATCGTATT-3′)〕和空白对照组(不做处理),转染48 h。

1.5HEC-1A细胞中HMGN5 mRNA表达 将细胞裂解液分别加入3组细胞中,总RNA提取、cDNA反转录、RT-PCR及HMGN5 mRNA相对表达量检测方法同1.4。

1.6细胞增殖检测 将3组细胞(100 μl)接种于96孔板中,细胞培养箱中培养后转染48和96 h,然后加入CCK-8液进行阻断,应用酶标仪检测450 nm波长处OD值。

1.7细胞迁移检测 将HEC-1A细胞进行胰蛋白酶消化后接种于6孔板,垂直板底画一条直线,冲洗掉滑落细胞,然后加入无血清培养基培养0、12和24 h后,用倒置显微镜拍照并用ImageJ软件计算划痕愈合率(基线划痕宽度与检测时间点划痕宽度差值/基线划痕宽度)。

1.8细胞侵袭检测 应用无血清培养液对基质胶进行稀释,铺于Transwell小室,备用。将转染48 h细胞转移到Transwell小室上室,下室中加入20%胎牛血清的培养液,培养48 h,冲洗后进行固定,加入结晶紫孵育30 min进行染色,高倍显微镜下随机选5个视野,计算细胞数。

1.9统计学分析 应用SPSS20.0软件进行t检验、χ2检验、方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1不同组织HMGN5 mRNA相对表达比较 子宫内膜癌组织HMGN5 mRNA相对表达量(4.56±0.32)显著高于癌旁组织(1.34±0.26,n=79;t=37.21,P<0.01)。

2.2HMGN5在不同临床特征下表达情况比较 不同年龄、FIGO分期、分化程度、淋巴结转移与否及基层浸润程度组间的HMGN5的相对表达量均具有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 HMGN5表达与子宫内膜癌临床病理特征关系

2.3HEC-1A细胞HMGN5 mRNA相对表达量及增殖活力比较 转染后,与空白对照组和HMGN5正常表达组相比,HMGN5 促进组具有较高的HMGN5 mRNA的表达量及增殖活力OD值,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 HEC-1A细胞不同HMGN5 mRNA相对表达量及细胞增殖活力

2.4HEC-1A细胞迁移及侵袭能力对比 与空白对照组和HMGN5正常表达组相比,HMGN5促进组转染培养12和24 h划痕愈合率和侵袭细胞数量均显著较高(P<0.05)。见表3,图1。

表3 HEC-1A细胞迁移及侵袭能力

图1 各组HEC-1A细胞迁移、侵袭

3 讨 论

子宫内膜癌在绝经后女性中发病率较高,伴随着诊疗技术的不断提高,子宫内膜癌患者的5 年生存率也逐渐升高,但是也有部分低分化及转移患者会出现预后不佳的情况〔6,7〕。前期研究表明,患者绝经时间、月经初潮时间及雌激素水平等均是子宫内膜癌的危险因素〔8〕。临床上子宫内膜癌的主要治疗方式是手术治疗,化疗和放疗等治疗方式常作为辅助治疗,但是治疗效果一般〔9〕。

前期研究显示,HMGN5基因在多种人类肿瘤中均呈现异常高表达;另有文献显示抑制HMGN5基因的表达可以明显抑制前列腺癌细胞的增殖〔10,11〕;激活HMGN5基因后,会显著促进膀胱癌细胞的增殖及侵袭〔12,13〕;抑制HMGN5基因的表达后,肾癌细胞及肺癌细胞的增长和侵袭显著降低〔14,15〕;另有研究显示,HMGN5基因在乳腺癌患者的癌症组织中呈现高表达,且可以促进乳腺癌细胞的侵袭和增殖〔16,17〕;骨肉瘤研究发现,抑制HMGN5基因的表达后对细胞周期具有阻滞作用,且对阿霉素诱导细胞凋亡的敏感性具有一定的抑制作用〔18,19〕。但是HMGN5基因在子宫内膜癌中的表达和作用还未有明确研究〔20〕。本研究提示,HMGN5表达上调与子宫内膜癌的病情进展相关,前期研究也表明,HMGN5所诱导的转录变化和细胞核小体的相互作用相关,该蛋白的异常表达和致瘤性增加相关,是一种强有力的原癌基因〔21〕。

本研究结果表明,提高HMGN5基因表达会促进人子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖;HMGN5基因能够促进人子宫内膜癌的侵袭和迁移能力;HMGN5基因在人子宫内膜癌发生发展过程中具有关键作用,HMGN5与细胞内染色质纤维完整性有相关性,其表达异常会损害细胞,参与肿瘤发生与发展。前期研究〔22〕与本研究结果相吻合,在正常肺组织中HMGN5低表达,而在肺癌细胞中相对高表达。对细胞中HMGN5基因进行抑制后,对肺癌LRNAI(-)aP细胞系生长有着明显抑制作用,其能够降低G2/M+S期细胞数量。

综上,人子宫内膜癌肿瘤组织中HMGN5呈现较高表达,对HMGN5基因进行促进对人子宫内膜癌HEC-1A细胞的增殖、迁移和侵袭有明显促进作用。HMGN5能够作为促癌基因在人子宫内膜癌的发生和发展过程中起着举足轻重的作用,其可能成为治疗子宫内膜癌靶向的靶点,但是仍需要深入研究HMGN5对人子宫内膜癌的具体作用机制。