环状RNA在急性缺血性脑卒中发生发展中的调控机制

郭舒琪 于志君 陈润吉 姜爱华 晏丹 袁琼

(武汉科技大学医学院新药创制研究所 职业危害识别与控制湖北省重点实验室,湖北 武汉 430065)

缺血性脑卒中(IS)是导致死亡和残疾的主要原因之一,其病理机制复杂,涉及能量代谢障碍、氧化应激损伤、炎症反应、细胞内钙超载、自噬、血脑屏障破坏、细胞凋亡等〔1〕。近年来随着测序技术和生物信息技术的飞速发展,缺血性脑卒中发病机制研究不断深入,环状RNA(circRNA)在IS发生、发展及预后修复中发挥着重要的作用。本文主要从circRNA概述、circRNA与IS相关性及circRNA作为竞争性内源RNA(ceRNA)在急性IS发生发展中的调控机制进行综述。

1 circRNA概述

circRNA是一类经过反向剪接,通过上、下游剪接位点以共价连接闭合形成环状结构的内源性单链非编码RNA〔2〕。与普通线性RNA相比,因缺少5'帽子及3'polyA 尾,可有效抵抗RNA外切酶的降解,因此稳定、广泛的分布在不同组织、细胞中,具有典型的组织特异性、细胞特异性〔3〕和时空特异性等特点〔4〕。 circRNA可根据剪接来源不同,分为外显子衍生的circRNA(ecircRNAs)、内含子衍生的circRNA(ciRNAs)和外显子-内含子衍生的circRNA(EIciRNA)〔5〕3类,其中外显子衍生的 circRNA 最为丰富。研究发现,大多数circRNA 定位于细胞质,少数circRNA 定位于细胞核内,他们可通过调节可变剪接、充当 microRNA(miRNA)海绵、隔离功能蛋白甚至编码蛋白等方式,在转录、转录后和翻译水平等多层面调控基因表达,参与重要病理生理进程〔3,6〕。circRNA的异常表达在肿瘤〔7〕、神经系统疾病〔8〕、心血管疾病〔9〕、糖尿病(DM)〔10,11〕等多种疾病的发生、发展中起关键的调解作用,目前circRNA已经成为疾病早期诊断、预后预测和靶向治疗研究的新热点。

2 circRNA异常表达与IS相关性

脑组织中存在大量特异性表达的circRNA,它们的存在与大脑发育、神经递质功能、神经元成熟和突触活动等密切相关〔8〕。越来越多的研究〔12～22〕发现,在IS细胞和动物模型及患者血样中存在circRNA异常表达,见表1。且其异常表达与IS发生、发展及预后密切相关。Lin等〔12〕对氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)的 HT22细胞进行微阵列芯片检测发现,15个circRNA 发生2倍以上的显著改变。Liu等〔13〕采用高通量测序技术对OGD/R处理的大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)中circRNA的表达进行检测,发现1 288个circRNA发生差异性改变,其中211 个上调和 326 个下调,功能富集分析表明circRNA异常表达与钙离子相关通路和环状鸟苷 3′,5′-单磷酸依赖性蛋白激酶信号通路相关。局灶性大脑中动脉阻塞/再灌注(MCAO/R)动物模型检测结果也发现circRNA存在不同程度的改变。脑缺血90 min再灌注6、12、24 h的缺血半影区有283个circRNA至少在一个再灌注时间点发生2倍以上的改变,其中16 个circRNA在所有时间点都发生改变〔16〕。急性IS患者血样检测中同样发现了circRNA的异常表达。Dong 等〔20〕发现,患者外周血中有521个circRNA 发生差异性改变,异常表达的circRNA主要富集MAPK、炎症、免疫等信号通路。Zuo等〔22〕对急性IS患者静脉血进行基因芯片检测,发现circFUNDC1,circPDS5B及circCDC14A表达显著上调,其表达水平与脑梗死体积正相关。研究还发现,3种circRNA在预后好及差的患者中变化趋势相反,于是推测他们可作为急性IS诊断及预后的生物标志物。随着测序技术的发展,越来越多的circRNA被发现在IS的异常表达,然而,目前对测序结果的分析仍存在弊端,这主要由于样本来源、测序方式、测序时间点及测序平台不同,致使获得的circRNA表达谱及可能参与的信号通路复杂、多样,无统一标准。如果完善数据库后能将细胞、动物以及患者血样的检测结果进行有效的结合,有望筛选出更多有价值的IS诊断标志物及功能靶标。

表1 circRNA在IS中异常表达

3 circRNA通过ceRNA机制调控IS损伤

3.1ceRNA调控机制 ceRNA机制是在各种RNA之间相互作用的一种全新的基因表达调控模式,主要指某些ncRNA,如长链非编码 RNA(lncRNA)、假基因和circRNA,可作为 miRNA的海绵通过与miRNA 反应元件(MREs)竞争性结合,最终影响 miRNA的靶基因mRNA的表达及功能。以往研究揭示circRNA作为ceRNA可通过调控细胞增殖〔23,24〕、炎症〔25〕、凋亡〔26,27〕、自噬〔28〕、血管新生〔29〕等病理生理进程参与多种疾病的发生发展。IS病理机制复杂,目前研究显示,circRNA 作为ceRNA可通过影响神经元凋亡、自噬、氧化应激、炎症及其他多种途径参与急性IS病理生理进程。

3.2circRNA调控IS细胞凋亡 细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式,是脑卒中后的主要病理现象。研究表明脑缺血损伤后数小时或脑缺血再灌注后,缺血半影区主要以凋亡为主。抑制细胞凋亡对IS患者的预后有较大帮助,被认为是IS防治的最为重要的途径。研究〔30～38〕显示,大量的circRNA可通过ceRNA 机制促进或抑制IS引起的细胞凋亡过程,见表2。

表2 circRNA作为ceRNA调控细胞凋亡

Chen等〔30〕发现,在IS体内、外损伤模型中circUCK2表达显著降低,过表达circUCK2可抑制miR-125b-5p活性,促进生长分化因子(GDF)11表达,从而激活下游转化生长因子(TGF)-β/Smad3信号通路减少细胞损伤,提高细胞存活率,抑制细胞凋亡。最新研究发现〔33〕,circTLK1在小鼠MCAO/R损伤模型及OGD/R 处理的N2a细胞中表达上调。敲除circTLK1显著减少梗死体积,改善神经功能。机制研究发现,敲低circTLK1 通过 miR-26a-5p/PTEN轴减轻OGD/R诱导的 N2a 细胞的凋亡,减轻神经元损伤。Xu等〔34〕在人脑BMECs缺氧处理后还发现,circPHC3高表达,敲低circPHC3抑制 OGD诱导的 BMECs细胞凋亡。进一步研究发现,circPHC3吸附miR-455-5p激活肿瘤坏死因子受体作用因子(TRAF)3,促进细胞死亡和凋亡。Dai等〔35〕也发现circHECTD1及TRAF3在OGD处理的HT22细胞及MCAO 小鼠中,表达上调,miR-133b表达下调。敲除circHECTD1可缓解OGD引起的HT22细胞死亡,改善MCAO小鼠脑梗死体积及神经元凋亡。下调circHECTD1可通过靶向miR-133b抑制TRAF3的表达,降低caspase-3和NF-κB活化,从而影响神经元凋亡。综上,circPHC3和circHECTD1尽管靶向不同的miRNA,但均可通过调节TRAF3的表达来影响细胞凋亡。可见,在ceRNA调控模式下不同circRNA还可通过吸附不同miRNA靶向调控同一或不同的mRNA在IS引起的细胞凋亡中发挥生物功能。

3.3circRNA调节IS细胞自噬 自噬是细胞组分的正常降解过程,是细胞中高度保守的分解代谢途径,在维持内环境稳定中发挥重要作用〔39〕。研究发现,适度自噬可抵抗IS造成的缺血缺氧环境,维持存活状态,但是过度自噬可导致细胞死亡〔40〕。随着对IS circRNA研究的深入,越来越多的研究发现,circRNA作为ceRNA 参与了IS细胞自噬的调节。

Han等〔41〕发现,在IS小鼠模型和患者血浆中circHECTD1表达均显著增加。敲低circHECTD1可显著减少脑梗死面积,减轻神经元损伤,抑制星形胶质细胞的活化。机制研究发现,circHECTD1可作为miR-142海绵,抑制TCDD诱导多聚ADP核糖聚合酶(TIPARP) 的表达,促进自噬。Zhou等〔42〕研究发现,circ-0025984 和TET1蛋白在IS星形胶质细胞中表达显著降低,miR-143-3p表达增加。抑制miR-143-3p 或过表达circ-0025984显著降低星形胶质细胞凋亡和自噬,减轻脑损伤和神经元丢失。进一步研究发现,这种神经保护作用主要与定位于细胞质中的circ-0025984充当miR-143-3p的海绵,靶向上调TET1表达有关。上调的TET1转位入核后,与ORP150启动子结合,将5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),导致DNA去甲基化,引起ORP150表达增加,进而增加LC3-Ⅱ表达,激活自噬。Xu 等〔43〕发现,在小鼠MCAO/R模型中circAkap7表达下调,当外源性给与脂肪来源间充质干细胞修饰的circAkap7外泌体(exo-circAkap7)可减轻脑损伤。研究发现exo-circAkap7可作为ceRNA海绵吸附miR-155-5p,促进ATG12介导的自噬,抑制 NRF2 介导的氧化应激,减轻神经细胞损伤。这表明circAkap7至少可部分通过促进自噬发挥保护作用。与此研究相似,星形胶质细胞外泌体来源的circSHOC2,可吸附 miR-7670-3p,调节沉默信息调节因子(SIRT)1的表达,通过调节自噬,改善神经元损伤〔44〕。

3.4circRNA调节细胞器膜稳态 细胞质膜(PM)与内质网(ER)之间的动态平衡,对维持细胞的正常功能至关重要。PM/ER之间的非囊泡脂质转移被认为在膜稳态维持中起主要作用〔45〕。 Shang等〔46〕发现,IS会打破PM和ER之间的脂质稳态,引起PM和ER之间的磷脂酰肌醇(PIs)和磷脂酰丝氨酸(PS)分布异常。其中ORP5 参与了PIs〔PI(4)P,PI(4,5)P2,PI(3,4,5)P3〕及PS在PM及ER的重新分配过程。进一步研究发现circRNA 0001449作为ceRNA通过竞争性结合miR-124-3p及 miR-32-5p,靶向调控氧固醇结合蛋白l5(Osbpl5)mRNA 的翻译过程,促使ORP5 蛋白表达增加。上调的ORP5促进PI(4)P或PI(4,5)P2从PM到ER的转运,从而消除了PM中PI(3,4,5)P3来源,进而减少PI(3,4,5)P3募集和AKT激活,最终加速细胞的损伤。因此认为 circRNA 0001449作为ceRNA 在IS PM及EM膜稳态的调节中起重要作用。

3.5circRNA多靶点、多通路调节血脑屏障(BBB)、炎症、氧化应激等 circRNA作为ceRNA在IS发生发展中的作用并非单一的,越来越多的研究显示,它可通过调节血脑屏障、炎症、氧化应激、增殖分化等多通路、多靶点的发挥调节功能。

BBB是神经血管单元的重要组成部分,它控制血液和大脑之间各种生物物质的交换。 在急性IS时BBB完整性被破坏,渗透性增高,血液成分渗入大脑,引起血管源性脑水肿、颅内压增高等一系列病理反应,损害正常的神经元。IS时,内皮-间质转化导致BBB破坏,Bai等〔47〕发现,在急性IS患者和小鼠IS模型中,circDLGAP4表达下调,上调circDLGAP4可显著抑制紧密连接蛋白和间充质细胞标志物表达,进而抑制内皮-间质转化。机制研究发现,circDLGAP4可作为内源性 miR-143 海绵,靶向抑制E6-APC末端结构域E3泛素蛋白连接酶(HECTD)1功能,通过调节BBB完整性相关的内皮-间质转化发挥保护作用。与此研究相似,Qiu 等〔48〕在OGD处理的HCN2细胞中也发现circDLGAP4表达下调。过表达circDLGAP4 可充当miR-503-3p 的海绵,促进神经生长调节因子(NEGR)1 mRNA及蛋白表达,增加细胞存活率,抑制细胞死亡和炎症反应,发挥保护作用。可见circRNA的作用可以是多靶点的,即同一circRNA可吸附不同miRNA发挥不同的生物功能。见表3。

表3 通过多通路、多靶点参与调控的circRNA

另外,Ren等〔49〕研究表明,circ-Memo1、SOS1在IS患者外周血及缺氧/复氧处理的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)中表达上调,miR-17-5p表达下调。沉默circ-Memo1可通过调节miR-17-5p/SOS1轴促进了细胞活力,抑制了ERK/NF-κB信号通路的激活,减少了氧化应激和炎症反应,并抑制了细胞凋亡,减轻缺氧/复氧引起的HBMEC细胞损伤。Yang等〔50〕研究发现,在OGD诱导的HBMEC细胞中,过表达circPHKA2可通过miR-574-5p/超氧化物歧化酶(SOD)2轴,促进增殖、迁移、血管新生,抑制凋亡、氧化应激、ER应激等减轻OGD诱导的HBMEC损伤,发挥保护作用。因此,circRNA发挥作用的途径还可以是多通路的,即同一circRNA可通过调节增殖、氧化应激、炎症等多个通路发挥生物功能。综上,circRNA作为ceRNA通过多靶点、多通路在IS的病理进程中发挥着十分重要的作用,这为其治疗指明了新的研究方向。

TLR4:Toll样受体4

4 展 望

大量的研究发现,circRNA不再是转录副产物,它可作为IS诊断标志物和分子靶点在疾病的发生、发展及预后发挥重要的生物功能。circRNA的ceRNA机制在IS的作用不是孤立的,它可以通过多靶点、多通路、多机制参与疾病发生发展的病理进程,从而为IS的诊断、治疗及药物研发提供重要理论依据。目前IS circRNA还有大量的circRNA有待发现,更多重要的机制有待进一步挖掘。