miR-34a-5p靶向调控MMP-9对类风湿关节炎大鼠氧化应激及滑膜细胞分化的作用机制

王建梅 强树华 高虹 刘丹丹 霍晶

(临汾市中心医院风湿免疫科,山西 临汾 041000)

类风湿关节炎(RA)主要特征为滑膜炎症、关节软骨破坏、骨质疏松和全身性炎症反应,具有高致残率的特点,有调查显示,其致残率高达50%,已经成为全球导致劳动能力丧失的第31位疾病,故有“不死的癌症”之称〔1〕。近年来研究表明,氧化应激在RA的发生、发展中具有极其重要的作用,发生氧化应激时,机体会产生大量活性氧簇和活性氮簇,从而导致机体抗氧化能力下降,进而造成滑膜组织、肺组织等的损伤,加重疾病,因此抗氧化应激对治疗RA至关重要〔2〕。RA的一个典型病理特征就是骨破坏,而破骨细胞是其中的关键因素,破骨细胞主要由滑膜细胞分化而来,故抑制滑膜细胞分化成破骨细胞对RA的发生和发展起着至关重要的作用〔3〕。基质金属蛋白酶(MMP)在RA的滑膜炎症和关节破坏中扮演着关键的角色,MMP-9是其主要成员,可促进血管中内皮迁移和形成新管腔,在RA血管翳的形成中扮演着重要角色〔4〕。近年来,越来越多的研究表明,微小RNA(miRNA)参与了RA的发生和发展过程,是骨损伤疾病最重要和最活跃的调控因子之一〔5〕。miR-34a-5p是一种可在不同器官发挥多效性调节功能的 miRNA,有研究表明,其可对成骨细胞起到一定保护作用,故促进miR-34a-5p表达可作为治疗RA的一个新靶点〔6〕。但其在治疗RA方面目前临床几乎没有研究,本文探讨miR34a-5p靶向调控MMP-9对RA大鼠氧化应激及滑膜细胞分化的作用机制

1 材料与方法

1.1动物材料 本实验选取湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供的70只SPF级SD雄性大鼠〔合格证书为:SCXK(湘)2020-0004〕,体质量210～270 g,温度26 ℃、52%相对湿度、自然光照下饲养,按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2实验材料 弗氏完全佐剂(货号:F5881,上海睿安有限公司);miR-34a-5p mimic(货号:CMR0082,广州威佳有限公司);重组腺病毒载体转染试剂盒(货号:GMS60036,上海杰美有限公司);MMP-9抑制剂盐酸多西环素(货号:YT69064,北京伊塔有限公司);苏木素-伊红(HE)染液(货号:BIR615,北京博尔西有限公司);光学显微镜(型号:E100,上海普赫有限公司);实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)仪(型号:6000,上海铂力有限公司);cDNA 第一链合成试剂盒(货号:YLK-T0057,上海优利科有限公司);多功能酶标仪(型号:Spark,北京赛百奥有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(货号:042-02801,广州威佳有限公司);丙二醛(MDA)试剂盒(货号:YT-C-A333,上海韵泰有限公司);4′,6-二氨基-2-苯基吡啶(DAPI)染色液(货号:FT21949yy,上海梵态有限公司);降钙素受体(CTR)抗体(货号:201675-T02,北京义翘神州股份有限公司);荧光显微镜(型号:Primo Star iLED,上海卡尔蔡司有限公司)。

1.3建模 随机选取55只大鼠,进行RA建模,大鼠固定好,后肢消毒,于足趾皮下注射0.1 ml弗氏完全佐剂,7 d后再注射1次,观察大鼠后肢情况,当出现明显红肿且后肿胀持续,则视为建模成功,建模过程中无大鼠死亡,全部建模成功。

1.4基因转染 根据重组腺病毒载体转染试剂盒说明书,将miR-NC和miR-34a-5p mimic质粒与载体分别加入不含血清的DMEM培养液中,并在温室条件下孵育10 min。然后,将等量的miR-NC和miR-34a-5p mimic加入脂质体中,并配制成转染液。最后,将密封保存这些转染液,以备后续的实验使用。

1.5分组及给药 从建模成功的大鼠中随机选取50只,将其分为模型(B)组,miR-NC(C)组,miR-34a-5p mimic(D)组,MMP-9抑制剂(E)组,miR-34a-5p mimic+MMP-9抑制剂(F)组,每组10只,同时随机选取10只正常大鼠作为正常对照(A)组,对C组给予尾静脉注射0.5 ml 1×105/ml的miR-NC,对D组给予尾静脉注射0.5 ml 1×105/ml的miR-34a-5p mimic,对E组给予尾静脉注射30 mg/kg的盐酸多西环素,对F组给予miR-34a-5p mimic联合盐酸多西环素,每组均1次/d,持续28 d,A、B组同期给予同体积生理盐水。

1.6标本采集 实验完成后,75 mg/kg的氯胺酮麻醉处死大鼠,腹主动脉取血离心取上清液于冰箱中密封保存,同时取滑膜组织,常规石蜡包埋、切片,4%多聚甲醛固定96 h,放入冰箱中密封保存。

1.7HE法检测大鼠滑膜组织病理形态 取部分滑膜组织,行脱蜡和至水处理后,用苏木素染色5 min,酸水及氨水中分色,各5 s,流水冲洗后,用70%及90%的酒精依次脱水10 min,用伊红染液染色2 min,染色完成后,用梯度乙醇和二甲苯进行脱水和透明化处理,最后使用中性树胶封片,用光学显微镜进行组织病理学观察。

1.8Real-time PCR 法检测大鼠滑膜组织中miR-34a-5p、MMP-9 mRNA相对表达 取各组滑膜组织,trizol 试剂提取总RNA,电泳仪检测其完整性,cDNA 第一链合成试剂盒逆转录合成 cDNA;利用Real-time PCR仪,在94 ℃条件下预变性10 min,变性30 s,70 ℃延伸1 min,59 ℃退火30 s,此循环进行40次,收集miR-34a-5p、MMP-9荧光信号,反应结束后进行数据分析,以同一样本中U6的Ct值作为内参,采用 2-ΔΔCt计算其基因相对表达量。引物序列(5′-3′):miR-34a-5p:上游TGCGCTGGCAGTGTCTT-AGCTG、下游CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA,长度145 bp;MMP-9:上游TGTACCGCTATGGTTACACTCG、下游GGCAGGGACAGTTGCTTCT,长度153 bp;U6:上游CTCGCTTCGGCAGCACA、下游AACGCTTCA-CGAATTTGCGT,长度128 bp。

1.9各组氧化应激相关指标检测

1.9.1黄嘌呤氧化酶法检测大鼠血清中SOD水平 取各组大鼠血清,严格按照其实验步骤进行实验,首先按照试剂说明书配制好试剂,然后用均匀器进行混匀,37 ℃水浴40 min后,在波长550 nm处进行蒸馏水凋零,实验完成后立即用酶标仪测定每孔光密度(OD)值,绘制标准曲线,然后通过标准曲线,计算SOD含量。

1.9.2硫代巴比妥酸法检测大鼠血清中MDA水平 取各组大鼠血清,严格按照其实验步骤进行实验,首先按照试剂说明书配制好试剂,然后用均匀器进行混匀,100 ℃水浴40 min后冷却,然后在3 000 r/min的条件下离心10 min,取上清液,用酶标仪在523 nm处测定每孔OD值,绘制标准曲线并计算MDA。

1.10免疫荧光法检测大鼠滑膜组织中破骨细胞标志物CTR蛋白表达 取各组滑膜组织,二甲苯及梯度乙醇脱蜡水化后,滴加适量pH6.0的0.01 mol/L枸橼酸缓冲液,然后放入微波炉进行组织抗原修复,修复完成后冷却至室温,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,加入封闭液封闭30 min后,滴加稀释的CTR一抗(1∶50),湿盒中4 ℃孵育过夜,PBS洗涤3次,滴加稀释后的荧光标记的免疫球蛋白(Ig)G二抗(1∶100),湿盒中37 ℃孵育1 h,PBS洗涤4次,滴加 DAPI避光孵育5 min,PBS洗涤4次,充分洗去多余的DAPI,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,荧光显微镜下观察并采集图像,使用IPP6.0软件对免疫荧光照片进行光密度分析。

1.11统计学分析 采用GraphPad Prism8.0软件行t检验、χ2检验、方差分析、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1各组滑膜组织HE染色结果 A组滑膜组织细胞结构正常且排列整齐,未见关节腔渗出、水肿、充血及炎性细胞浸润现象,B、C组出现弥漫性滑膜细胞和纤维组织增生,并可见大量血管翳形成及大量炎性细胞浸润现象,D、E、F组可见滑膜细胞轻度增生及少量炎性细胞浸润和新生毛细血管形成,水肿、充血情况明显改善,见图1。

图1 各组滑膜组织(HE染色,×400)

2.2各组滑膜组织中miR-34a-5p、MMP-9 mRNA相对表达结果 与A组比较,B组、C组滑膜组织中miR-34a-5p mRNA表达显著降低,MMP-9 mRNA明显升高(均P<0.05),B组与C组相比无明显差异(P>0.05),与C组相比,D、E、F组滑膜组织中miR-34a-5p mRNA表达显著升高,MMP-9 mRNA显著降低(P<0.05),且D组与E组相比无明显差异(P>0.05),而F组较E组变化显著(P<0.05),见表1。

2.3各组血清中氧化应激相关指标 与A组比较,B、C组血清中SOD含量显著降低,MDA明显升高(均P<0.05),B组与C组相比无明显差异(P>0.05),与C组相比,D、E、F组血清中SOD含量显著升高,MDA显著降低(均P<0.05),且D组与E组相比无明显差异(P>0.05),而F组较E组变化显著(P<0.05),见表1。

表1 各组滑膜组织中miR-34a-5p、MMP-9 mRNA相对表达及血清中SOD、MDA含量

2.4所有大鼠miR-34a-5p与MMP-9相关性 miR-34a-5p与MMP-9呈负相关(r=-0.952,P<0.001)。

2.5各组滑膜组织中CTR蛋白表达结果 A、B、C、D、E、F组滑膜组织中CRT蛋白表达(0.54±0.05、2.12±0.12、2.13±0.12、1.35±0.11、1.36±0.12、0.69±0.07),差异有统计学意义(F=38.430,P<0.001),与A组比较,B、C组滑膜组织CTR蛋白表达明显升高(P<0.05),B组与C组相比无明显差异(P>0.05),与C组相比,D、E、F组滑膜组织CTR蛋白表达显著降低(P<0.05),且D组与E组相比无明显差异(P>0.05),而F组较E组显著降低(P<0.05),见图2。

图2 各组滑膜组织CTR蛋白表达(免疫荧光,×400)

3 讨 论

RA目前已被世界卫生组织定为医学界难治性疾病,几乎所有患者关节功能都会出现不同程度的丧失,同时累及血液、消化、呼吸系统等多种器官,对患者及其家庭,乃至社会均造成了极大负担〔7〕。miRNA能通过与基因表达调控相关的mRNA结合,从而抑制或降低目标基因的表达,近年来研究发现,其被发现在包括RA在内的多种疾病中起着重要的调控作用〔8〕。

本研究发现,促进miR-34a-5p对RA具有治疗作用。miR-34a-5p作为miR的一种,其可通过多种方式调控下游靶基因,进而参与细胞凋亡、增殖等多种生物学活动,同时有研究表明,其可通过调控成骨细胞及破骨细胞功能参与骨损伤疾病的病理过程〔9〕。RA的致病因素复杂,但有研究表明其主要与炎症、自身免疫反应等多种机制导致的细胞外基质降解引起的关节系统损伤有关〔10〕。MMP-9可以降解胶原蛋白,参与滑膜细胞的迁移、侵袭及滑膜血管新生等过程,高水平的MMP-9活性与RA关节炎症的严重程度和滑膜细胞异常增殖有关〔11,12〕。而对于RA大鼠,miR-34a-5p激动剂可能是通过促进miR-34a-5p的转录及翻译,来促进其蛋白质的合成及促进其识别MMP-9的RNA,从而参与基因转录后水平的调控、并降解MMP-9,达到影响MMP-9基因蛋白质合成的目的,进而抑制细胞外基质的合成与降解、并参与细胞过程的调控、抑制炎性因子的分泌、促进滑膜细胞的凋亡等,最终有效改善疾病状况。霍新慧等〔13〕研究发现,MMP-9在RA大鼠关节滑膜组织中表达升高,给予治疗后其水平显著降低,这与本文结果类似。

本研究表明,miR-34a-5p激动剂可显著抑制氧化应激。SOD可清除活性氧生成过程中的初始产物,是机体内氧自由基的头号杀手,可保护细胞免受自由基攻击,因此其被看作自由基的第一线防御机制;而MDA是细胞膜被氧化后形成的脂质过氧化物,在机体内脂质过氧化损伤中扮演着重要角色,可对细胞具有直接的损伤作用,其含量的多少反应机体内脂质过氧化损伤的程度,同时也是组织器官损伤的重要标志,因此SOD及MDA均是反映氧化应激状态的重要指标〔14,15〕。近年来研究发现,在RA中,氧化应激水平升高会引起滑膜细胞的功能失调和炎症的发生,因此如何抑制氧化应激是目前临床工作的重点所在〔16〕。对于RA大鼠,miR-34a-5p激动剂可能是通过抑制上游免疫细胞的活化及相关信号通路的表达,来抑制细胞凋亡因子在滑膜细胞中的表达、抑制细胞外基质的合成与降解等,从而抑制钙离子的转运、抑制多种黏附分子基因表达剂细胞膜脂质过氧化、抑制部分蛋白酶的活性,并改善细胞膜的流动性及通透性,进而有效清除氧自由基、到达抑制氧化应激水平,减少血小板聚集和血栓形成的目的,最终有效改善疾病症状。孙艳秋等〔17〕研究发现,RA中SOD含量显著降低,MDA显著升高,Linc00638在RA患者中低表达,过表达Linc00638可显著改善氧化应激指标,这与本文结果类似。

本研究说明,miR-34a-5p激动剂可有效抑制滑膜细胞向破骨细胞分化。RA属于慢性自身免疫性疾病,以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现,其一个典型病理特征就是骨破坏,因此如何抑制骨破坏是近年来医学领域关注的焦点之一〔18〕。而破骨细胞是造成RA骨破坏的关键细胞,其主要来源于关节滑膜细胞的分化,其中CTR是破骨细胞表面的标志性分子,故其水平的变化可有效反映滑膜细胞分化成破骨细胞的程度〔19〕。而对于RA大鼠,miR-34a-5p激动剂可能是通过调控免疫炎症相关信号通路,来抑制免疫炎症反应,从而参与细胞膜、细胞质等细胞器的形成,影响破骨样分化因子的生成,进而抑制滑膜细胞分化成破骨细胞,到达抑制破骨细胞活性的目的,最终有效减轻骨损伤。贺龙刚等〔20〕研究发现,RA中破骨细胞数量明显增多,给予治疗后,破骨细胞数量明显减少,病理症状明显改善,这与本文结果类似。