滋肾丸对KKay小鼠肝脏胰岛素抵抗以及PI3K-Akt-FOXO1通路的影响

陈源 吴悠 吴丽丽 秦灵灵 刘铜华

糖尿病是一类以高血糖和糖脂代谢障碍为特征的代谢性疾病,中医认为其核心病机为“阴虚燥热”[1-2]。滋肾丸是一首中医经典名方,方中只有知母、黄柏、肉桂三味药,常用于淋证、癃闭等肾系疾病。方中知母、黄柏滋阴清热,肉桂反佐,基本符合糖尿病病机。前期动物实验已经证实滋肾丸具有一定的降糖效果,如郭晓媛[3]用滋肾丸醇提取物对db/db小鼠干预四周后空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平开始下降,并能减轻糖尿病肾病肾小管早期肾损害,改善肾功能。Tang等[4]将db/db小鼠分成滋肾丸三个剂量组,发现其显著降低小鼠血糖及糖化血红蛋白水平,并改善其糖耐量,其降糖效果可与罗格列酮不相上下。实验室前期研究发现滋肾丸可通过增加Occludin和ZO-1蛋白在肠道中的表达来增强肠道屏障功能和降低全身炎症,改善骨骼肌形态,调节骨骼肌胰岛素信号通路[5]。肝脏也是胰岛素的重要靶器官之一,本研究将基于肝脏胰岛素通路,进一步验证其在自发性糖尿病动物模型KKay小鼠中的降糖作用,以及探讨其改善肝脏胰岛素抵抗的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

KKay小鼠21只,5周龄;C57BL/6J小鼠7只,5周龄,由北京华阜康生物科学有限公司提供,饲养于北京中医药大学SPF级动物房,室温(25±2)℃,相对湿度(50±5)%,昼夜循环12小时/12小时人工光照条件下,自由饮水,正常维持饲料喂养。普通饲料为小鼠全价营养颗粒饲料,KKay小鼠专用高脂饲料由北京华阜康生物科学公司提供(货号:1042)。

1.2 伦理审查

本研究的动物实验经北京中医药大学动物伦理委员会批准(伦理号:BUCM-4-2019031003-1089)。

1.3 实验药物

知母、黄柏、肉桂中药饮片购买于北京同仁堂制药公司。

滋肾丸水提物提取:将中药饮片知母300 g、黄柏300 g、肉桂45 g混合,浸泡在10倍药重的蒸馏水中1小时,煮沸45分钟后收集药液。再次加入相同体积的水煮沸45分钟,将两次的煎剂一起放入旋转蒸发仪中浓缩至645 mL,得到1g/mL浸膏。将浓缩的浸膏分装收集在50 mL的EP管中并保存在-20℃冰箱中,每次灌胃前纯水稀释。

1.4 实验仪器与试剂

便携式血糖仪(GLUCOCARD 01-min plus,日本爱科来医疗科技有限公司,型号:GT-1970);酶联免疫检测仪(美国,Promega,型号:E9032);凝胶成像系统(美国,Bio-RAD公司,型号:ChemiDocTMXRS);研磨仪(上海净信科技有限公司,型号:JXFSTPRP-24);实时荧光定量PCR仪(美国,Thermo Fisher Scientific,型号:7500);台式高速冷冻离心机(美国Sigma Aldrich公司,型号:3K15);紫外分光光度计(瑞士梅特勒-托利多国际有限公司,型号:UV5Nano)。

RNA Easy Fast Tissue/cell Kit(北京天根生化科技有限公司,货号:DP451);HiScript®III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技有限公司,货号:R323);GO Taq®RT-Qpcr System(美国Promega生物技术有限公司,货号:A6001);小鼠超敏胰岛素ELISA试剂盒(美国ALPCO Diagnostics,货号:80-INSMSU-E01)。

1.5 造模、分组与给药

在适应性喂养3周后,所有小鼠禁食不禁水12小时,尾尖采血法测量FBG。据FBG及体重结果按随机区组设计将KKay小鼠分为3组:滋肾丸高剂量组、滋肾丸低剂量组、模型组;C57BL/6J小鼠为正常组。滋肾丸高剂量组根据人剂量10 g黄柏、10 g知母、1.5 g肉桂,换算小鼠生药给药量2.8 g/kg。小鼠每天同一时间段灌胃给药一次,滋肾丸高剂量组予2.8 g/kg,滋肾丸低剂量组予1.4 g/kg,模型组及正常组予等体积蒸馏水,连续给药6周。

1.6 标本采集

第6周末次给药后,禁食不禁水12小时,摘取眼球取血,置于离心管中,不抗凝,室温下静置30分钟后在4℃,3 000 r/min条件下离心15分钟,吸取上清液于-20℃保存;取出肝脏,将组织的一小部分固定在多聚甲醛溶液中用于形态学观察,其余部分收集在管中并立即用液氮冷冻。

1.7 指标检测

1.7.1 FBG测定 每周固定时间,将小鼠禁食不禁水12小时,取尾尖血,用葡萄糖氧化酶法测定FBG,采用配套血糖仪及试纸。

1.7.2 口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT) 第6周末次给药后,禁食不禁水12小时,测小鼠FBG作为0分钟血糖,按2 g/kg给小鼠灌胃葡萄糖溶液进行OGTT试验,测定30分钟、60分钟、120分钟血糖,计算曲线下面积(area under curve,AUC)。

AUC=0.5×(Bg0min+Bg30min)/2+0.5×(Bg30min+Bg60min)/2+1×(Bg60min+Bg120min)/2

其中Bg0min为0分钟血糖,以此类推。

1.7.3 酶联免疫吸附法测定胰岛素水平 将吸取的血清冷冻保存后检测空腹血清胰岛素(fasting insulin,FINS)水平,并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR)。

HOMA-IR=FBG·FINS/22.5

1.7.4 肝脏组织染色 新鲜肝脏组织经4%多聚甲醛固定24小时后,石蜡包埋,3～5 μm切片,根据苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色试剂盒及糖原过碘酸雪夫染色(periodic Acid-Schiff staining,PAS)试剂盒使用说明书步骤进行,常规光学显微镜高倍镜镜检,观察肝脏组织形态及糖原分布情况,拍照保存图片。

1.7.5 qRT-PCR法测定相关基因表达水平 将肝脏组织从-80℃冰箱取出,试剂盒提取总RNA,按照PCR操作要求及Promega试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA并扩增,反应条件: 50℃2分钟,95℃10分钟,(95℃15秒,60℃1分钟,40循环),95℃15秒,60℃1分钟,95℃30秒,60℃15秒。以模型组的基因表达为对照,采用2-△△Ct法计算得到各个样本之间相对的基因表达水平。检测基因为胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)、叉头框蛋白1(forkhead box O1,FOXO1)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6pase)、葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)基因表达水平。所测基因引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 滋肾丸对KKay小鼠空腹血糖的影响

与正常组相比,模型组小鼠的血糖显著升高(P<0.05);与模型组相比,滋肾丸低剂量组小鼠在第3、5、6周血糖显著降低(P<0.05),从第1周开始至用药结束,滋肾丸高剂量组小鼠空腹血糖显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),且下降幅度比滋肾丸低剂量组大。见表2。

表2 滋肾丸对KKay小鼠空腹血糖的影响

2.2 滋肾丸对KKay小鼠糖耐量的影响

与正常组相比,模型组小鼠的0分钟、30分钟、60分钟、120分钟血糖及AUC均显著升高(P<0.05);与模型组相比,滋肾丸高、低剂量组0分钟、30分钟、60分钟、120分钟血糖及AUC均显著下降(P<0.05)。见表3。

表3 滋肾丸对KKay小鼠糖耐量的影响

2.3 滋肾丸对KKay小鼠胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的影响

与正常组相比,模型组FINS水平显著降低(P<0.05),提示早期胰岛调节功能受损;与模型组相比,高、低剂量滋肾丸均显著提升FINS水平(P<0.05),考虑滋肾丸可以改善早期胰岛功能。与正常组相比,模型组HOMA-IR显著升高(P<0.05),提示胰岛素抵抗。与模型组相比,高、低剂量滋肾丸均显著降低HOMA-IR水平(P<0.05),提示滋肾丸可以改善胰岛素抵抗。见表4。

表4 滋肾丸对KKay小鼠胰岛素水平及胰岛素抵抗指数的影响

2.4 肝脏组织病理学观察

2.4.1 HE染色 光镜下观察小鼠肝脏细胞HE染色情况。正常组肝组织肝小叶结构清晰,肝索排列规则整齐,以中央静脉为中心呈放射状分布,未见脂质沉积;模型组肝脏形态紊乱,肝小叶肝索结构消失,肝细胞肿大变性,存在大量脂肪空泡及脂质沉积。与模型组相比,滋肾丸高、低剂量组肝小叶结构较为清晰完整,肝索排列较正常,肝窦排列较为规则,中央静脉结构较完整,空泡样改变明显减少。见图1。

注:A 正常组;B 模型组;C 滋肾丸低剂量组;D 滋肾丸高剂量组。

2.4.2 PAS染色 光镜下观察小鼠肝脏糖原染色,胞质PAS反应阳性物质即为糖原,显示为紫红色,细胞核为蓝色。正常组肝细胞内紫红色糖原颗粒分布均匀,数量适中,提示血糖正常平稳。与正常组相比,模型组肝细胞内紫红色颗粒显著减少,提示肝脏糖原合成减弱;与模型组相比,滋肾丸高、低剂量组紫红色颗粒数量显著增加,提示糖原显著增多,与PCR结果相一致,表明滋肾丸剂量依赖性促进糖原合成,抑制肝糖输出从而起到降低血糖的作用。见图2。

注:A 正常组;B 模型组;C 滋肾丸低剂量组;D 滋肾丸高剂量组。

2.5 滋肾丸对KKay小鼠IRS-1、PI3K、AKT2、FOXO1、PEPCK、G6pase、GCK基因表达量的影响

与模型组相比,滋肾丸各剂量组FOXO1、PEPCK、G6pase的mRNA表达量均显著降低(P<0.05),且滋肾丸高剂量组下降幅度比低剂量组大。与正常组相比,模型组FOXO1的mRNA表达量显著上升(P<0.05),但PEPCK、G6pase的组间差异不符合预期。

与正常组相比,模型组GCK mRNA表达量显著降低(P<0.05);与模型组相比,滋肾丸低剂量组GCK mRNA表达量有上升趋势,但无统计学意义(P>0.05);高剂量组GCK mRNA表达量显著上升(P<0.05)。

与模型组相比,滋肾丸给药后IRS-1、PI3K及Akt2的mRNA有上升趋势,但组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 滋肾丸对KKay小鼠肝组织相关靶基因的影响

3 讨论

中药治疗糖尿病具有多通路、多靶点的优势特点,在当前时代背景下运用现代技术探究及阐明其内在作用机制是极其必要的。滋肾丸是来源于中医古籍中的经典方剂,组方精妙,量小药少而力专,方中以等量知母、黄柏为主,二者皆气寒味苦入肾经,泻火坚阴,在组方配伍中常相须而用。《本草经解》言知母“主消渴热中,除邪气”,《本草经疏》云黄柏“以至阴之气,补至阴之不足,虚则补之,以类相处”。二者相合,少佐温阳化气之肉桂共同起到滋阴化气之效,尤宜于消渴病之下消证。本实验参考既有文献研究[4],以10∶10∶1.5的比例制成水提物,探究其降糖机制及量效关系,以冀对临床中方剂应用提供帮助。

肝胰岛素通路有转录水平以及蛋白磷酸化水平两方面的调节作用,相关研究已证实IRS、PI3K、Akt是通路上的三个重要节点[6]。在生理条件下,胰岛素分泌入血后,沿着IRS-1/PI3K/Akt2/FOXO1信号通路发生级联反应,首先与肝细胞膜上的特定INSR结合,通过募集底物IRS-1,IRS-1多个酪氨酸残基磷酸化,募集PI3K催化二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸磷脂酰肌醇,后者进一步与下游Akt结合并磷酸化激活Akt。目前发现Akt有3种亚型,Akt1表达于大部分组织,Akt2主要表达于胰岛素效应组织,Akt3则高度表达于脑和睾丸组织[7]。目前的研究表明Akt2是葡萄糖代谢所必需的[8]。肝脏Akt2激活后进一步磷酸化FOXO1使其失活,从而释放下游糖异生基因转录及抑制葡萄糖产物生成。胰岛素通过这些受体激活和信号蛋白的招募/磷酸化,在肝细胞质膜上启动近端胰岛素的一系列蛋白磷酸化反应。

FOXO1是肝脏胰岛素信号级联的关键一步,是代谢信号到细胞核的延续与转接[9]。资料显示,在高脂喂养的小鼠中肝脏FOXO1 mRNA表达降低40%也足以降低基础的肝脏葡萄糖生成[10]。正常生理条件下,FOXO1停留在细胞核内,进食状态时在胰岛素作用下磷酸化失活从细胞核转移到细胞质,从而禁用其转录因子活性;在糖代谢紊乱及炎症状态下,FOXO1会发生细胞核移位从而被激活,激活的FOXO1结合转录辅激活因子过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α[9](peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC1-α),以协调糖异生转录程序,可以靶向提高PEPCK、G6pase两个关键酶的基因表达水平来促进糖异生。活性FOXO1还与辅阻遏子SIN3A结合,降低GCK的表达,进一步促进葡萄糖输出[11]。

GCK是己糖激酶的一种,仅存在于肝细胞和胰岛β细胞中,具有绝对专一性,其作用是催化葡萄糖生成葡萄糖-6-磷酸(glucose6-phosphate,G6p)。后者是糖原合成酶(glycogen synthase,GS)的底物,也是别构激活剂[12-13],可以促进糖原合酶的激活,提高糖原合成水平。GCK还受血糖浓度影响,在生理条件下,高血糖也可导致葡萄糖激酶从细胞核转移到细胞质[14],从而促成葡萄糖-G6p流动。GCK催化G6p的生成同时也是有氧氧化的开始,所以GCK同时控制着肝脏葡萄糖的利用与储存[3]。目前GCK已成为潜在的治疗靶点,且已经出现了小分子的激活剂[15]。

本实验以基因突变的KKay小鼠为2型糖尿病对照,在遗传易感的基础上饲以高脂饲料[16],造成外周组织对胰岛素敏感性降低,与人类2型糖尿病表现极为相似。实验结果表明,滋肾丸可显著降低KKay小鼠的FBG、OGTT AUC及HOMA-IR,PCR显示滋肾丸可以降低小鼠FOXO1、PEPCK、G6pase基因表达,提高小鼠的GCK基因表达,另外通过PAS染色也证实给药后肝脏糖原增加。这些证据均提示药物可能通过降低FOXO1从而上调GCK基因表达、下调糖异生酶基因表达,抑制糖异生及促进肝糖原合成,从而改善肝脏胰岛素抵抗,降低血糖水平,可能跟IRS-1-PI3K-Akt2胰岛素信号通路有关。PCR结果提示上游IRS-1、PI3K、Akt2基因表达水平改变无统计学意义。考虑到胰岛素在上述位点的作用与转录后蛋白磷酸化有关,仍需完善蛋白免疫印迹实验进一步验证。此外,滋肾丸复方成分复杂,本实验只探索了该复方对胰岛素通路上的其中一条进行了研究,有可能还涉及到其他的胰岛素通路,仍有待进一步探索。