基于网络药理学和分子对接技术探讨黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经病变和类风湿性关节炎“异病同治”的作用机制

王惠敏 王欢欢 冯梅 高源 董莹莹 柏冬

黄芪桂枝五物汤原载于《金匮要略·血痹虚劳病篇》,由黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣组成,具有益气温经、和血通痹的功效,为治疗血痹之常用方剂[1]。据统计,黄芪桂枝五物汤主治病证共52条,痹证有37条,其中又以血痹居多,有28条,其余痹证有痿痹、痛痹、风痹麻木等[2]。

糖尿病性周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是一组以感觉和自主神经症状为主要临床表现的周围神经病变,西医常给予控制饮食、适当锻炼等基础治疗和修复神经、抗氧化应激、改善微循环、改善代谢紊乱等对症治疗[3]。类风湿关节炎(rheumatic arthritis,RA)是一种慢性、破坏性的自身免疫性疾病[4],RA的相关治疗以抗炎为关键策略[5]。中医药在预防疾病及并发症方面具有许多优势,尤其在慢性病方面有其独特的优势[6]。

中医药具有多成分、多靶点的特点,体现了中医“一方多治”[7]的思想观念,而网络药理学可以从多靶点、多途径的角度阐释药理机制,探索药物与疾病之间的靶点和通路关系,并在此基础上阐明中药的复杂作用机制[8-9]。因此,本研究利用网络药理学分析方法,从中医“异病同治”的角度初步探讨黄芪桂枝五物汤治疗DPN、RA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 黄芪桂枝五物汤活性成分的收集

以黄芪桂枝五物汤中黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣5味药材为关键词,利用中药系统药理学分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[10](https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、TCM Database@Taiwan(http://tcm.cmu.edu.tw/)[11]及文献检索收集药物的主要活性成分。其中,以口服生物利用度≥30%,药物相似性≥0.18为TCMSP中药有效成分的筛选参数;以有生物活性和药理作用报道且含量较高但未符合筛选标准的成分也纳入候选活性成分为文献相关成分筛选标准。将以上数据库所得的结果合并后进行去重得到相关药物的活性成分。

1.2 黄芪桂枝五物汤潜在靶点预测

利用TCMSP数据库对有效活性成分的蛋白靶点预测,并结合蛋白质数据库(UniversalProtein,UniProt)(https://www.uniprot.org/)[12]数据库中UniProKBt的检索功能,校正靶基因名称;通过PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]数据库获得这些成分的Smiles号、2D Structure,然后将Smiles号导入SwissTargetPrediction(http://www. swisstargetprediction.ch/)[14]数据库,限定研究对象为homo sapiens,以probability>0为卡值进行筛选。将2D Structure以SDF格式下载,导入Pharmmapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[15]数据库中,设置Norm Fit≥0.9为筛选条件,将筛选的靶点蛋白通过Uniprot数据库中的ID mapping进行官方名称校正;将得到的活性成分导入Stitch(http://stitch.embl.de/)[16]数据库,限定研究对象为homo sapiens,combined score>0.4为筛查标准得到相关靶点。

1.3 疾病靶点的筛选

以“diabetic peripheral neuropathy”和“rheumatic arthritis”为关键词,在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)(http://www.omim.org/)、基因卡(GeneCards)(https://www.genecards.org/)[17]数据库进行检索,选择物种为“Homo sapiens”,搜集DPN和RA相关疾病靶点。

1.4 蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建与关键靶点筛选

利用STRING平台数据库(https://string-db.org/)[18]进行共有靶点的蛋白间相互作用关系,物种设置为“Homo sapiens”,combined score>0.9,将结果利用Cytoscape3.7.2软件中CytoNCA插件绘制PPI网络图,并进行拓扑分析,分析内容包括度中心性(degreecentrality,DC)、介度中心性(betweenness centrality,BC)、特征向量中心性(eigenvetor centrality,EC)、接近中心性(closenesscentrality,CC)、网络中心性(network centrality,NC)和局部边连通性(localaverage connectivity,LAC)等5个指标。

1.5 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genesand genomes,KEGG)通路富集分析

为进一步了解黄芪桂枝五物汤异病同治相关生物途径及机制,采用Hiplot(https://hiplot.com.cn/)数据库,以P<0.05为筛选条件,选择物种为“org.Hs.eg.db”进行黄芪桂枝五物汤治疗DPN、RA靶基因的GO和KEGG的信号通路富集分析,得到相应的功能分析和信号通路分析数据,使用在线绘图网站对数据进行可视化,得到富集分析条形图、气泡图。

1.6 “药物—成分—靶点—通路”网络构建

将交集靶点与其相关的活性成分和KEGG富集得出的生物通路来源Cytoscape3.7.2软件构建出“药物—成分—靶点—通路”网络。

1.7 黄芪桂枝五物汤中有效活性成分与DPN、RA作用靶蛋白的分子对接验证

本文通过Pubchem数据库获取药物主要成分的2D结构信息,采用Chem3D软件中将2D结构转化为MOL2格式并将其用作配体;同时通过蛋白质结构数据库(protein data bank,PDB)[19](https://www.rcsb.org/)数据库下载受体蛋白的3D结构,以PDBQT格式保存。使用Autodock Too1.5.6软件分别对小分子和靶蛋白进行加氢、去水分子及小分子配体处理,借助PyMOL2.3.4软件插件找到对接活性位点,即可在Autodock Vina软件将处理后的成分及靶蛋白进行分子对接,最后通过PyMOL2.3.4软件将结果进行可视化。

2 结果

2.1 黄芪桂枝五物汤活性成分及筛选的靶点

通过TCMSP、TCM Database@Taiwan及文献筛选,获得黄芪桂枝五物汤有效成分122个。其中黄芪29个,白芍29个,桂枝18个,大枣32个,生姜14个,删重后获得107个活性成分。

2.2 DPN及RA疾病靶基因收集结果

通过GeneCards、OMIM数据库搜集DPN、RA相关疾病靶点,去重后获得DPN疾病靶点共5175个,RA疾病靶点共1155个,将以上两组疾病靶点与黄芪桂枝五物汤1226个作用靶点进行交集,分别获得交集靶标690个、295个,见图1。

注:韦恩图为黄芪桂枝五物汤靶基因与DPN、RA疾病靶基因交集情况,重叠部分为交集靶基因的数目。

2.3 网络的构建与分析

2.3.1 DPN 通过STRING数据库进行PPI,并通过Cytoscape 3.7.2软件进行可视化分析, 根据CytoNCA分别构建黄芪桂枝五物汤治疗DPN与RA的核心基因。 结果显示, 黄芪桂枝五物汤治疗DPN的交集靶点进行拓扑分析, 第一次计算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC的中位数分别为7、265.1110536、0.007323334、0.066040975、2.3666666665、3.333333333,然后再进行第二次计算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC 的中位数分别为19、59.49633452、0.049733732、0.495412844、8.24、9.791666667,根据大于中位数的筛选标准,选出55个关键节点(660条线)。见图2。

注:A黄芪桂枝五物汤干预DPN的PPI蛋白互作网络图,图中节点表示共有靶蛋白,节点度值与颜色的深浅及节点面积呈正相关;B PPI核心靶蛋白前15个度值条形图。

2.3.2 RA 黄芪桂枝五物汤治疗RA的交集靶点进行拓扑分析,第一次计算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC的中位数分别为5、106.3969241、0.015385864、0.110451848、1.625、2.666666667,然后再进行第二次计算得到DC、BC、EC、CC、LAC、NC的中位数分别为12、25.202572975、0.090339437、0.521428571、6.2916666665、7.39488012,根据大于中位数的筛选标准,选出26个关键节点(177条线)。见图3。

注:A 黄芪桂枝五物汤干预RA的PPI蛋白互作网络图,图中节点表示共有靶蛋白,节点度值与颜色的深浅及节点面积呈正相关;B PPI核心靶蛋白前15个度值条形图。

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

2.4.1 DPN 通过对690个预测靶点进行KEGG和GO分析,得到黄芪桂枝五物汤治疗DPN的主要途径和生物学过程(见图4、5)。结果显示,在GO富集分析方面,生物过程(biological process,BP)主要涉及了对脂多糖的反应、对氧化应激的反应等过程;细胞组成(cellular component,CC)主要涉及了膜筏、膜微区、膜区等过程;分子功能(molecular function,MF)主要涉及了蛋白酪氨酸激酶活性、配体激活的转录因子活性等过程。在KEGG通路富集方面,主要涉及了磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol trikinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路、晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)-糖基化终末产物受体(receptor of AGEs,RAGE)信号通路等。

图4 黄芪桂枝五物汤治疗DPN的GO富集分析

图5 黄芪桂枝五物汤治疗DPN的KEGG富集分析

2.4.2 RA 通过对295个预测靶点进行KEGG和GO分析,得到黄芪桂枝五物汤治疗RA的主要途径和生物学过程(见图6、7)。结果显示,在GO富集分析方面,BP主要涉及了炎症反应的调节、对细菌来源分子的反应等过程;CC主要涉及了膜筏、膜微区、膜区等过程;MF主要涉及了核受体活性、内肽酶活性等过程。在KEGG通路富集方面,主要涉及了肿瘤坏死因子(transforming necrosis factor,TNF)信号通路、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)信号通路等。

图6 黄芪桂枝五物汤治疗RA的GO富集分析

图7 黄芪桂枝五物汤治疗RA的KEGG富集分析

2.5 “药物—成分—共有靶点—通路”网络构建结果

通过Cytoscape 3.7.2软件构建“药物—成分—靶点—通路”网络图,图中共有节点863个,边9337条,根据度值及相关文献报道,黄芪桂枝五物汤中活性成分含量较高的化合物有黄芪甲苷、芍药苷、肉桂酸、6-姜酚、枣树皂苷等,在黄芪桂枝五物汤干预DPN以及RA的过程中起重要作用。见图8、表1。

注:红色正方形表示药物;粉色圆形表示成分;倒立三角形代表靶点,淡绿色表示黄芪桂枝五物汤与DPN交集靶点,绿色表示黄芪桂枝五物汤与RA交集靶点,蓝色表示黄芪桂枝五物汤与两种疾病共有交集靶点;菱形代表通路,红色表示DPN通路,橘色表示RA通路,黄色表示DPN和RA共有通路;墨绿色正三角形代表DPN和RA两种疾病。

2.6 分子对接结果

选取每个药物中含量较高且度值较高的成分,利用分子对接筛选可能的有效成分,故选取黄芪中的黄芪甲苷(Astragaloside IV)、白芍中的芍药苷(Paeoniflorin)、桂枝中的肉桂酸(Cinnamic acid)、生姜中的6-姜酚(6-gingerol)、大枣中的枣树皂苷(Jujubasaponin V)这5个成分作为对接成分,分别对应DPN度值排名靠前关键靶蛋白Src非受体酪氨酸激酶(Src non-receptor tyrosine kinas,SRC)、信息转导及转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)及RA的关键靶蛋白相关因子A(related A,RELA)、JUN(Activator protein-1,AP-1)、STAT3进行分子对接验证。若结合能<0,表明配体分子均能和受体蛋白能自发的结合,结合能<-4.0 kcal/mol,表明其结合良好。其中Jujubasaponin V-MAPK3、JUN、RELA以及astragaloside IV-RELA结合最稳定,均≤-9.6 kcal/mol(见表2、3)。就化合物Jujubasaponin V小分子配体与受体MAPK3大分子蛋白质的结合方式而言,SER-110、GLN-372、LYS-224、TYR-24、ARG-41的氨基残基与Jujubasaponin V小分子配体形成疏水相互作用(如图9A);对于Jujubasaponin V小分子配体与受体JUN大分子蛋白质的结合方式而言,ASP-464、ARG-541、GLN-166、ASP-163的氨基残基与Jujubasaponin V小分子配体形成疏水相互作用(如图9B);图9C显示的是Jujubasaponin V小分子配体与受体RELA大分子蛋白质的结合方式,ASP-53、THR-52、ARG-260、GLU-222、GLN-241、ILE-224的氨基残基与Jujubasaponin V小分子配体形成疏水相互作用;图9D显示的是astragaloside IV小分子配体与受体RELA大分子蛋白质的结合方式,ARG-260、ARG-50、LYS-28、GLN-241、LYS-221、ILE-224的氨基残基与Astragaloside IV小分子配体形成疏水相互作用。

表3 分子对接得分结果

注:A 绿色为Jujubasaponin V,蓝色为MAPK3氨基酸残基;B 绿色为Jujubasaponin V,蓝色为JUN氨基酸残基;C 绿色为Jujubasaponin V,蓝色为RELA氨基酸残基;D 绿色为Astragaloside IV,蓝色为RELA氨基酸残基。

3 讨论

DPN在中医上属于消渴病的变证,属于“血痹”范畴,其基本病机为气血亏虚,阴阳两虚,筋脉失养,导致寒、麻、肌萎缩[20-21];RA在中医上归属于“痹证”范畴,机体肝肾亏损、气血不足等是其发病的内因,风、寒、湿、热等外邪侵袭是其外因,最终导致气血痹阻而发为痹[22]。DPN和RA虽为“异病”,但是两病都具有病程长且久病多虚多瘀的特点,因此两病的发病过程中伴有气虚血瘀证,根据中医理论“证同治亦同”[23], 对于气虚血瘀证临床就可以采用补气活血化瘀的方法。方中黄芪为君,甘温益气,补在表之卫气。桂枝散风寒而温经通痹,与黄芪配伍,益气温阳,和血通经。桂枝得黄芪益气而振奋卫阳;黄芪得桂枝固表而不致留邪。芍药养血和营而通痹,与桂枝合用调营卫而和表里,两药为臣。生姜辛温,疏散风邪以助桂枝之力;大枣甘温,养血益气以资芪、芍之功;与生姜为伍,又能和营卫,调和诸药,以为佐使,共奏益气温经、和血通痹的功效。

大量的临床研究表明,补气活血方治疗RA和糖尿病的临床疗效确切,具有减少西药副作用、提高疗效的作用。郭洪涛等[24]通过数据挖掘发现,RA和糖尿病虽然是两种不同的疾病,但都是以高频率的补气活血药物和祛除瘀血来治疗。针对这些症状,均采用了益气温经、和血通痹的治疗方法,证实了两种疾病在其证候特点的相同点,也推出了两者“异病同治”的客观存在性。李征锋等[25]通过临床观察患者治疗前后的血糖、关节肿胀和C反应蛋白(C-reactionprotein,CRP)水平,证明降糖药和抗风湿药的联合使用可以提高益气活血方对RA合并糖尿病患者的临床疗效。这也为本文通过黄芪桂枝五物汤的网络药理学和分子对接研究“异病同治”的机制提供了理论依据。

现代药理研究表明,黄芪桂枝五物汤具有较强的抗炎[26-27]、抗氧化、免疫调节、促进神经修复作用等功效[28]。根据上述分析结果显示,黄芪桂枝五物汤中的活性成分黄芪甲苷、芍药苷、肉桂酸、6-姜酚等活性成分含量较高且有较多的靶点富集,在干预疾病中有重要的作用。黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一,据报道,它能有效降低糖尿病大鼠的血糖及血脂水平,改善抗氧化酶生物活性,减少氧化应激造成的病理性损伤[29],并且可以使巨噬细胞从M1样表型向M2样表型再极化促进骨细胞存活,减轻关节炎症状、减少炎性细胞因子等作用[30];芍药苷具有抗炎、抗氧化、抗高血糖等多种生物功能[31],它能抑蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号的过度激活从而减轻母胎妊娠糖尿病大鼠血糖和胰岛素水平的失调[32],并且可以减轻氧化应激,增加细胞增殖和迁移,减少凋亡[33]。杨新伟等[34]研究发现,芍药苷通过激活DPN小鼠的核因子E2-相关因子2/抗氧化反应元件(nuclear factor-E2 related factor2/antioxidant response element,Nrf2/ARE)通路和B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)相关凋亡通路来减轻氧化应激,从而发挥神经保护作用。6-姜酚具有强心、保肝利胆、调血脂、抗血小板凝聚、抗氧化、抗肿瘤等作用[35]。孙立等[36]通过链脲佐菌素方法诱导糖尿病小鼠模型发现,姜酚对糖尿病小鼠肾损伤具有良好的保护作用,其作用机制可能与干预NADPH氧化酶源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)信号,发挥抗氧化作用密切相关。马武开等[37]研究发现,姜酚通过下调模型大鼠血清白介素17(interleukin 17,IL-17)和白介素23(interleukin 23,IL-23)的表达,可以使滑膜增生减轻,炎细胞浸润、水肿改善,达到治疗RA的目的。并且6-姜酚、肉桂酸已被证明在各种神经系统疾病中具有抗氧化和抗炎作用,如缺血性脑损伤、奥沙利铂引起的周围神经病变等[38-40],为DPN、RA的治疗提供积极意义。

PPI网络显示了黄芪桂枝五物汤不同靶点之间的相互作用,在这些靶点中,SRC、STAT3、RELA等具有较高度值,可能是治疗疾病关键的靶点。同时通过分子对接技术对筛选得到的活性成分及靶点进行了验证,结果显示黄芪桂枝五物汤在治疗DPN时大枣皂苷与MAPK3靶蛋白结合活性最好,在治疗RA时大枣皂苷与RELA、 AP-1结合活性最好,提示黄芪桂枝五物汤在干预DPN、RA均发挥着重要作用。STAT3的激活可导致促炎细胞因子的产生和免疫反应增加,通过抑制其可以改善实验性自身免疫性关节炎的严重程度,有助于调节细胞间的平衡[41-42]。并且通过p-KO小鼠相关研究表明,STAT3调节胰岛细胞血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor,VEGF)是内分泌胰腺和胰岛微血管网络的正常发育和维持所必需的[43],在调节细胞命运、炎症和自身免疫疾病方面发挥着关键作用[44]。RELA是核因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)家族一个重要的成员,可精准调控NF-κB的转录活性,在调节炎症、肿瘤、代谢以及免疫应答等方面起重要作用[45-46]。由此推测黄芪桂枝五物汤对于DPN、RA的干预涉及多种靶蛋白,这些可能是黄芪桂枝五物汤对于两者异病同治的潜在治疗靶点。

根据KEGG通路富集分析结果,黄芪桂枝五物汤可以通过相同的信号通路和不同的信号通路来治疗两种疾病,它们有一定的相似性和内在关系,但也有不同之处,以便关注不同的方向,为研究提供新的启迪。首先,在共性方面,在本文中用黄芪桂枝五物汤治疗两种疾病的过程中发现AGEs、RAGE信号通路贯穿始终。AGE-RAGE信号通路中AGE的主要受体(RAGE或AGER)属于免疫球蛋白超家族[47],它激活多个细胞内信号通路,包括NADPH氧化酶、蛋白激酶C和促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)[48],而且可以在各种类型的细胞和器官中诱导氧化应激和炎症[49-50]。黄芪桂枝五物汤可减轻DPN的机制可能与阻断AGEs/RAGE/NF-κB信号通路中组织细胞表面RAGE的表达、抑制NF-κB激活及其引发TNF- α触发的氧化应激和过度炎症反应有关,从而避免细胞受损和功能紊乱有关[51]。同时,晚期糖基化终产物受体可激活促炎因子的分泌,导致关节炎症,并且和炎症细胞因子结合将进一步激活诱导氧化应激和基质金属蛋白酶(matrix metallo-proteinase,MMP)的NF-κB通路,这些分子有助于软骨的进一步降解,增加一般炎症[52-53]。因此,我们发现黄芪桂枝五物汤可能是通过调节细胞基本功能、抗炎、调整免疫、抗氧化、修复神经等作用参与治疗DPN、RA。

其次,它们的特征方向不同。在DPN中,细胞凋亡为DPN发病的重要机制,在DPN病程中伴随施万细胞功能紊乱与凋亡、大量周围神经元凋亡等病理特征[54]。相关研究发现[55],线粒体凋亡途径在促进DPN的发生中有重要作用,如PI3K/Akt、mTOR、JAK激酶/信号传导及转录激活因子(janus kinase /signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)、腺苷酸活化蛋白激酶/过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(adenylate activated protein kinase/peroxlsome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,AMPK/PGC-1α)通路经线粒体机制诱导DPN细胞凋亡。近年来研究发现,PI3K/Akt信号通路参与神经元和胶质细胞增殖、凋亡等过程,另外,作为胰岛素信号关键的下游通路,可调控体内的糖代谢,是高血糖胞内靶点之一,当其表达异常时促进诸多疾病的发生,与DPN的发病密切相关[55-56]。梁俊清等[57]研究发现,在高糖损伤条件下,周络通提取物Z-6上调nNOS蛋白磷酸化水平,抑制促凋亡因子及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteiny laspartate specific 3,Caspase-3)关键蛋白酶的表达,降低Schwann细胞凋亡率,从而提高糖损伤细胞的存活率,这些作用与PI3K/Akt通路有关。并且研究证实,胰岛素样生长因子I可以显著抑制Caspase-9和Caspase-3前体的剪切活化从而抑制高糖影响下细胞的凋亡,这主要是通过PI3K/Akt信号通路发挥其作用的[58]。综上所述,本文结果分析显示,PI3K/Akt信号通路富集了大多数的靶基因,是黄芪桂枝五物汤治疗DPN的主要途径,黄芪桂枝五物汤通过激活PI3K/Akt通路,抑制神经细胞凋亡[59]、刺激神经细胞突触再生[60],从而发挥保护神经作用。

RA属中医学“痹证”范畴。其主要病机为肢体筋脉、关节、肌肉、经络闭塞不通,中医治疗以祛邪通络、养血活血为法。黄芪桂枝五物汤具有益气温经、和血通痹之效,符合本病的病机,在治疗上可取得较好疗效。同时许多临床研究亦报道黄芪桂枝五物汤治疗RA临床疗效可靠[61]。在本文中,发现黄芪桂枝五物汤的有效成分对应的靶点有一系列炎症相关因子,如TNF、IL-6、IL-7、IL-2等。KEGG通路分析显示,TNF信号通路、IL-17信号通路、NOD样受体(Nod-like receptors,NLRs)信号通路、TLRs信号通路与黄芪桂枝五物汤的炎症相关。据报道,黄芪桂枝五物汤的有效成分,如黄芪甲苷具有调节免疫、保护心脏、抗炎和抗肿瘤等作用[62]。同时,研究发现黄芪桂枝五物汤中总苷、皂苷、总黄酮对患者机体免疫功能有调节作用[63-65]。这说明黄芪桂枝五物汤可以通过减少炎症因子、调节免疫等来达到治疗RA的目的。

细胞凋亡是RA的发病机制之一[66]。实验数据表明,通过抑制信号通路或抑制抗凋亡分子的表达来诱导巨噬细胞、滑膜成纤维细胞或淋巴细胞的凋亡,可能对RA有治疗作用[67]。并且有相关研究表明,促炎细胞因子TNF-α和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)在RA患者中刺激滑膜细胞增殖并通过凋亡抑制滑膜细胞死亡。因此,促炎细胞因子导致的细胞凋亡缺陷可能有助于滑膜细胞的生长,最终导致RA患者的增生或血管翳形成和关节破坏[68]。

TLRs信号通路是I型跨膜蛋白受体,TLRs介导免疫的信号转导途径中的TLRs/NF-κB信号通路在免疫调节中发挥着极其重要的作用[69]。已经有很多研究者发现多种TLRs在RA和实验性关节炎的滑膜组织、成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synovial cells,FLS)、滑膜组织中的巨噬细胞和血单核细胞等细胞中高表达,同时也发现了在关节局部存在着一些TLRs的内源性配体[70]。其中,TLR2和TLR4在RA的发病中起重要作用。小鼠关节炎模型研究表明,早期阶段通过活化TLR2,促进血管发生炎症细胞黏附与侵袭,活化的TLR4在发病后期增加金属蛋白酶介导的破骨细胞形成[71]。髓样分化因子88是存在于所有TLRs信号转导通路中的一个关键的接头蛋白,对TLR4和IL-1R信号起负性调控作用[72]。根据本文KEGG结果显示,此信号通路在黄芪桂枝五物汤治疗RA中起到关键作用。

TNF信号通路是黄芪桂枝五物汤治疗RA的主要途径,主要涉及炎症反应、细胞免疫、肿瘤免疫等方面[73]。据报道,黄芪桂枝五物汤通过下调TNF-α诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的胱天蛋白酶3(Recombinant Caspase 3,CASP3)、TNF、RELA和B细胞编码κ轻链多肽基因抑制激酶B(inhibitor of kappa light polypeptidegene enhancer in B-cells,kinase beta,IKBKB)蛋白表达,从而发挥抑制炎症反应、调节免疫功能及调控细胞凋亡的作用[74]。据报道,过量的TNF-α不仅可以使其信号通路发生异常,还可以和其他促炎性细胞因子刺激破骨细胞分化和活化,而引起骨丢失,刺激滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生降解软骨的蛋白酶[75],导致RA患者滑膜中免疫细胞的活化、滞留和生存等,最终导致关节和软骨的破坏[76]。综上所述,黄芪桂枝五物汤治疗RA有效。现代药理研究表明,黄芪桂枝五物汤具有良好的抗炎、调节免疫活性及抗细胞凋亡。本文的网络药理学研究也显示了黄芪桂枝五物汤对RA炎症因子和通路的广泛作用。

总之,黄芪桂枝五物汤通过网络药理学研究,根据其治疗DPN、RA等病的共同机制,理解“同治异病”的策略,试图揭示“异病同治”的科学内涵,也说明了黄芪桂枝五物汤可以通过相同的通路及不同的通路治疗两种疾病。两者有一定共性,并具内在联系,但也有不同之处,以便侧重方向的不同,为研究提供新的启示。

在本文中,以黄芪桂枝五物汤的益气温经、和血通痹作用为例,了解中医“同治异病”的策略。黄芪桂枝五物汤对DPN、RA的治疗作用主要是通过对AGE-RAGE信号通路整体调节来实现的,但对不同的病变有不同的侧重。DPN的治疗主要依靠抑制神经细胞凋亡、刺激神经细胞突触再生,从而发挥保护神经作用。而RA的治疗往往依赖TNF信号通路、Toll样受体信号通路等炎症相关通路的调控,减少炎症因子、调节免疫。结果表明,黄芪桂枝五物汤通过多靶点、多途径的复杂调控,达到了“异病同治”的效果,可为中医药关于“异病同治”研究提供一定的启示。但由于目前网络药理学的研究仍有局限性,后续仍需要进行体内、外实验验证,以进一步确认本文预测结果的准确性。