净制对乌梅质量的影响及乌梅肉质量标准的研究

杨琳琳 辛洁萍 张姝妍 王 鑫 谭景匀 王 璇 程水清 文 佳 徐新房 李向日

(北京中医药大学中药炮制研究中心/中药品质评价重点实验室,北京,102488)

乌梅为蔷薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果实,具有敛肺,涩肠,生津,驱蛔的功效[1],主产于四川、福建、云南等[2]。其化学成分包括枸橼酸等有机酸类成分等[3],具有抑菌、调节肠道菌群等多种药理作用[4]。

乌梅的净制最早出现在汉代《伤寒论》中[5]。研究表明乌梅肉中枸橼酸的含量明显高于乌梅[6]。王贵林和张昊[7]比较乌梅、乌梅肉、乌梅核对豚鼠离体胆囊平滑肌作用后发现乌梅肉对胆囊的松弛作用较强。为保证临床用药安全有效,需要研究净制对乌梅质量的影响。

乌梅肉临床应用广泛，如《伤寒论》中经典名方乌梅丸，方中大量使用乌梅肉为君药[8]。中药的质量是影响临床用药的关键[9]。《中华人民共和国药典》2020年版收载了乌梅、乌梅肉和乌梅炭3种饮片规格，其中，乌梅肉项仅对炮制方法进行了规定，其他质量标准项缺失。在地方炮制规范中，仅《山东省中药饮片炮制规范·2012版》[10]对乌梅肉有较详细的测定，但未规定含量测定项。标准中乌梅肉部分质量标准项缺失、地方炮制规范限度指标是否合理等问题严重影响乌梅肉的质量控制，亟须规范乌梅肉的质量标准，以保证临床乌梅肉饮片质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 检测器2489(型号:UV/Vis Detector)、进样器(型号:Alliance 2695),高效液相色谱仪(沃特世公司,美国,型号:Waters-e2695)、色谱柱(Agilent公司,美国,型号:Agilent Zorbax SB-C18,4.6 mm×250 mm,5 μm),显微镜(奥林巴斯公司,日本,型号:BX51),FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司,型号:DFT-100),十万分之一电子天平(赛多利斯仪器系统公司,德国,型号:SARTORIUS BS110S),电子天平(上海越平科学仪器有限公司,型号:FA1104),电热鼓风干燥箱(常州诺基仪器有限公司,型号:DHG-9070A)、超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司,型号:SB25-12DTDN),数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司,型号:KQ-600DE)。

1.2 试药 乙腈[色谱级,赛默飞世尔科技(中国)有限公司,批号:387L-25962U]、磷酸[色谱级,赛默飞世尔科技(中国)有限公司,批号:218128]、磷酸二氢铵(分析纯,北京化工厂,批号:20110111)、枸橼酸对照品(含量99.7%,中国食品药品检定研究院,批号:100396-202104)、熊果酸对照品(含量99.9%,中国食品药品检定研究院,批号:110742-201823)、乌梅对照药材(中国食品药品检定研究院,批号:121208-201707)、娃哈哈矿泉水(杭州娃哈哈集团有限公司,批号:3121GH)。

1.3 样品信息 12批乌梅样品经北京中医药大学李向日教授鉴定,均为蔷薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果实。21批乌梅肉,其中12批为乌梅样品蒸制所得各批次乌梅肉;其余9批来源于亳州市沪谯药业有限公司和亳州中药材市场,经北京中医药大学李向日教授鉴定为蔷薇科植物梅Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.的干燥近成熟果实的果肉。样品信息见表1。

表1 乌梅肉样品信息及外观性状

2 方法与结果

2.1 乌梅2种净制方法的比较研究

2.1.1 蒸制时间的考察 取WM0101 250 g,置于蒸锅内平铺一层,查看不同蒸制时间乌梅的软化程度。蒸制20 min时,样品基本软化,但随着剥肉时间的推移,未净制的样品开始发硬,不易剥取;30 min时所得软化药材易于剥取;到40 min时,部分样品果肉成泥状,软化过度。故实验采用了蒸制30 min进行软化。

2.1.2 润制时间的考察 取WM0101 250 g,用润湿的纱布包裹好,平铺一层放于搪瓷盘内润制,并随时查看乌梅的润制程度,确定润制时间。乌梅润制时间较长,6 h时仍无法剥取,故润制时间定为润制过夜,所得样品易于剥取,无破烂。

2.1.3 净制 蒸法:取WM0101、WM0102、WM0103各250 g,置于蒸锅内平铺一层,蒸制30 min,取出,趁软剥肉,置50 ℃烘箱内烘干,即得。见图1。产率见表2。润法:取WM0101、WM0102、WM0103各250 g,用润湿的纱布包裹好,平铺一层放于搪瓷盘内至润透,取出,剥肉,置50 ℃烘箱内烘干,即得。见图1。产率见表2。

图1 乌梅肉

表2 乌梅肉2种净制方法的比较(%)

2.1.4 水分 依照《中华人民共和国药典(四部)》2020年版通则水分测定法第二法测定。见表2。

2.1.5 浸出物 依照《中华人民共和国药典(四部)》2020年版通则水溶性浸出物测定法项下的热浸法测定。见表2。

2.1.6 枸橼酸含量测定

2.1.6.1 提取次数的考察 取WM0101-R,依照《中华人民共和国药典》2020年版乌梅【含量测定】项下供试品溶液制备方法,制备提取1次、2次的供试品溶液,依照高效液相色谱法测定。乌梅肉中枸橼酸提取次数的考察结果见表3。

表3 乌梅肉中枸橼酸提取次数(%)

结果表明第1次提取所得枸橼酸含量小于第1次提取所得枸橼酸含量的5%,说明提取完全。

2.1.6.2 枸橼酸含量测定 依照《中华人民共和国药典》2020年版乌梅【含量测定】项下高效液相色谱法测定。枸橼酸高效液相色谱图、蒸乌梅肉色谱图见和润乌梅肉高效液相色谱图见图2。枸橼酸含量测定结果见表2。乌梅肉样品色谱峰面积与枸橼酸对照品的面积比为1～1.5∶1,因此《中华人民共和国药典》所载乌梅枸橼酸检测方法可用于乌梅肉中枸橼酸的检测。

图2 乌梅肉样品和对照品高效液相色谱图

2.2 净制对乌梅质量的影响

2.2.1 乌梅样品的净制 蒸法:取净乌梅,置于蒸锅内,蒸制30 min取出,趁软剥肉,置50 ℃烘箱内烘干,即得。见图3。乌梅不同部位产率见表4。

图3 乌梅、乌梅核及乌梅肉样品

表4 乌梅不同部位的产率(%)

2.2.2 水分 依照《中华人民共和国药典(四部)》2020年版通则水分测定法第二法测定。乌梅各部位水分见表5。

表5 乌梅不同部位浸出物及枸橼酸含量测定结果(%)

2.2.3 浸出物 依照2020年版《中华人民共和国药典(四部)》通则水溶性浸出物测定法项下的热浸法测定。乌梅各部位浸出物结果见表5。

2.2.4 枸橼酸含量测定 依照《中华人民共和国药典》2020年版乌梅【含量测定】项下高效液相色谱法测定。乌梅各部位高效液相色谱图见图4,枸橼酸含量见表5。

图4 乌梅不同部位高效液相色谱图

本实验采用蒸法对乌梅进行软化,剥肉,各部位占比见图5。乌梅肉的平均占比为35.9%,乌梅核的平均占比为56.8%。因此,为保证临床用药剂量的准确性,去核是非常有必要的。与乌梅饮片比较,乌梅肉和乌梅核在浸出物以及枸橼酸的含量上比较差异有统计学意义(P<0.001)。与乌梅核比较,乌梅肉在浸出物以及枸橼酸的含量上比较差异有统计学意义(P<0.001)。因此净制去核是非常有必要的。见图6。

图5 乌梅肉产率

图6 乌梅不同部位浸出物与枸橼酸含量测定结果

2.3 乌梅肉质量标准的研究

2.3.1 性状 对乌梅肉的色泽、气味、质地进行描述、记录。21批乌梅肉的性状描述见表1,乌梅肉外表皮黑色或灰色,内部红棕色,无核。味酸。

2.3.2 鉴别

2.3.2.1 显微鉴别 取乌梅肉粉末(过二号筛),水合氯醛装片后在显微镜下观察。乌梅肉的显微鉴定结果见图7。非腺毛,单细胞,呈弯曲或钩状,包腔内含黄棕色物。果皮表皮细胞淡黄棕色,多角形,壁稍厚,部分有非腺毛或毛茸脱落后的痕迹。石细胞淡绿色或棕黄色,胞腔内含黄棕色物。纤维单个或成束,壁黄色,呈梭形。含螺纹导管、具缘纹孔导管。

图7 乌梅肉显微鉴定

2.3.2.2 薄层鉴别 取乌梅肉粉末2 g,加甲醇30 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水20 mL使溶解,加乙醚振摇提取2次,每次20 mL,合并乙醚液,蒸干,残渣用石油醚(30～60 ℃)浸泡2次,每次15 mL(浸泡约2 min),倾去石油醚,残渣加无水乙醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。另取乌梅对照药材5 g,同法制成对照药材溶液。再取熊果酸对照品,加无水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。按照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述3种溶液各1～2 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(20∶5∶8∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。

乌梅肉薄层鉴别结果见图8,在供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色斑点。

图8 乌梅肉薄层鉴别

2.3.3 水分 依照2020年版《中华人民共和国药典(四部)》通则水分测定法第二法测定。21批乌梅肉的水分测定结果见表6。12批自制乌梅肉的平均水分为10.7%,9批市售乌梅肉的平均水分为12.0%,21批乌梅肉水分的平均含量为11.3%,标准差1.9%。其中WMR0109为异常值。去除异常值后,20批乌梅肉的平均水分含量为11.0%,标准差为1.4%。在20批水分平均值的基础上加上其2倍的标准差,作为水分的限度标准,故将水分的标准拟定为:不得过13.0%。

表6 乌梅肉水分、浸出物、枸橼酸含量测定结果(%)

2.3.4 浸出物 依照2020年版《中华人民共和国药典(四部)》通则水溶性浸出物测定法项下的热浸法测定。21批乌梅肉的浸出物测定结果见表6。12批自制乌梅肉的平均浸出物为72.5%,9批市售乌梅肉的平均浸出物为71.3%,21批乌梅肉的平均浸出物含量为72.0%,标准差为3.4%。在21批浸出物平均值的基础上减去其2倍的标准差,作为浸出物的限度标准,故将浸出物的限度标准拟定为:【浸出物】照水溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定,不得少于65.0%。

2.3.5 枸橼酸含量测定 依照《中华人民共和国药典》2020年版乌梅【含量测定】项下高效液相色谱法测定。21批乌梅肉的枸橼酸含量测定结果见表6。12批自制乌梅肉的平均枸橼酸含量为33.1%,9批市售乌梅肉的枸橼酸含量为34.8%,21批乌梅肉枸橼酸平均含量为33.8%,标准差为4.5%。在21批枸橼酸含量的平均值的基础上减去其2倍的标准差,故将枸橼酸的含量限度标准拟定为:【含量测定】同药材,含枸橼酸(C6H8O7)不得少于25.0%。

2.3.6 小结

传统的性状鉴定方法具有直观、快速的特点。乌梅肉是由乌梅去核而得,其外表皮黑色或灰色,内部红棕色,无核。味酸。

在乌梅肉的显微鉴别中,非腺毛单细胞,呈弯曲状或作钩状,胞腔内含黄棕色物。石细胞淡绿色或棕黄色,胞腔内含黄棕色物。纤维单个或成束,壁黄色,呈梭形。含螺纹导管、具缘纹孔导管。果皮表皮细胞淡黄棕色,表面观类多角形,壁稍厚,非腺毛或毛茸脱落后的痕迹多见。其中石细胞、纤维、导管和表皮细胞在显微镜下观察到的数量较少,多数为非腺毛。

在薄层鉴别中,乌梅肉与乌梅对照药材色谱和熊果酸对照品在薄层色谱的相应的位置上,显相同颜色斑点,这与乌梅药材的鉴别方法一致,但考虑到乌梅肉中熊果酸的含量高于乌梅,故在取样量上进行了减少,以免供试品浓度过高,造成拖尾。

水分是中药饮片在储存过程保证质量的一项重要指标。水分过高,霉菌新陈代谢的作用增强,生长繁殖加快,易引起中药饮片的虫蛀、霉变。浸出物测定对于控制中药材和饮片质量具有重要意义,尤其是对于有效成分不明确或者多类成分均具有药效作用的中药。对乌梅肉水溶性浸出物采用热浸法测定,要求是不得少于40.0%。本实验测得除去异常值WMR0109之外的20批乌梅肉水分的平均含量为11.0%,符合《中华人民共和国药典》饮片水分通常不得过13.0%的要求,WMR0109的水分结果为17.2%,远远超过乌梅肉均值,该水分下乌梅肉极易发霉变质,去除异常值可以更好更贴合实际制定乌梅肉饮片标准。考虑到生产的实际情况,乌梅肉水分不得过13.0%。本实验测得21批乌梅肉的水溶性浸出物平均值为72.0%,考虑到生产的实际情况,将乌梅肉浸出物照水溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定,不得少于65.0%。提高了乌梅肉水溶性浸出物的限度要求,以便更好控制乌梅肉质量。实验测得21批乌梅肉枸橼酸含量为33.8%。考虑到生产的实际情况,认为乌梅肉含枸橼酸(C6H8O7)不得少于25.0%。

3 讨论

本实验对乌梅蒸和润的软化时间进行考察。最后确定蒸法蒸制30 min,润法润制过夜,对乌梅样品进行净制得到乌梅肉。从产率、浸出物以及枸橼酸含量等方面,比较了2020年版《中华人民共和国药典》中收载乌梅肉蒸制、润制2种净制方法的差异,结果发现:二者并无显著性差异。在净制时间上,蒸法所用时间远短于润法,且润法软化时会存在部分饮片表面质地较硬,水分不易渗透的现象;净制后的烘干采用50 ℃低温烘干[11],在烘干时间上,蒸法与润法没有差别,故本实验未将烘干时间纳入考察范围。因此本实验后续选择了蒸法对乌梅进行净制。

乌梅净制可以去除非药用部位,提高枸橼酸及浸出物含量。通过对乌梅的核和肉2个部位的浸出物以及枸橼酸含量的比较,发现二者存在极显著性差异,且乌梅样品大小不一,果核的占比不同,为了保证临床用药的准确性,净制是非常有必要的。对于净制对乌梅质量的影响研究,本实验仅基于浸出物及枸橼酸含量进行研究,未对净制过程中可能出现的其他化学成分传递与转化规律进行研究,课题组后续将通过液质联用技术研究不同净制方法对乌梅化学成分的影响。在2020年版《中华人民共和国药典》乌梅【含量测定】项下,所用粉末为最粗粉,即过一号筛,而实验中所得一号筛粉末颗粒较大,尤其乌梅核占比较大,容易造成取样不均匀,测定数据不准确,故实验时采用二号筛粉末进行测定,建议《中华人民共和国药典》乌梅【含量测定】项进行相应修改。

乌梅肉为敛肺涩肠常用药[12-15],临床应用广泛,需求量大。其质量是影响临床疗效的关键,本实验通过提高乌梅肉的水分、浸出物标准要求及增加含量测定限度,对乌梅肉质量标准进行完善,以期对市场上乌梅肉的质量进行控制,更好地保证临床疗效。乌梅肉较乌梅药效物质含量明显升高,更利于临床疗效的发挥,但市场上乌梅肉饮片并不广泛流通,建议引起饮片生产企业和中医临床的重视,保证乌梅肉饮片的临床供应,提高中医临床疗效。

利益冲突声明:无。