利用CRISPR/Cas9系统制备斑马鱼cbsb敲除模型

陈福海 蒋林 曹建斌 蒋伟青 项略 顾珊烨 刘犇

硫化氢（H2S）作为一种有毒气体，早先被认为在非硫生物体内无特殊生理功能。然而近几十年的研究发现绝大部分哺乳动物中都含有编码H2S 生成酶的基因，暗示其可能作为内源性气体递质发挥重要的细胞功能[1]。胱硫醚-β-合成酶（cystathionine beta-synthase，CBS）是在哺乳动物中鉴定得到的3 个H2S 合成酶之一，当受维生素B6催化时能使丝氨酸与同型半胱氨酸合成胱硫醚，后者进一步代谢产生H2S 分子[2]。目前已有实验室构建了稳定的CBS 编码基因（Cbs）敲除小鼠[3-4]，证实了CBS 在正常生理状态和疾病中都发挥着重要功能，包括心血管、神经、免疫、肿瘤等[5-8]。斑马鱼Danio rerio 作为低等脊椎动物研究模型，具有个体小、易养殖、体外受精且早期发育快、幼鱼透明易于活体成像、遗传操作方法丰富且高效等诸多研究优势[9]，已逐渐成为全球第三大模式动物，并已开发出多种荧光标记的遗传品系供活体观察和研究，涉及的组织器官有心血管系统、免疫系统、骨骼系统、神经系统等[10]。为了更深入细致地研究CBS 的功能，尤其是在发育过程中和正常生理情况下，本研究拟构建斑马鱼中CBS 同源的胱硫醚-β-合成酶b 基因（cystathionine beat-synthase b gene，cbsb）的敲除品系，旨在为后续深入研究胱硫醚-β-合成酶b（cystathionine beta-synthase b，Cbsb）的功能提供基础动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物 实验用AB/WT 斑马鱼品系饲养于中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心感觉整合与行为研究组的斑马鱼研究平台，采用北京爱生科技发展有限公司公司斑马鱼集中养殖和繁育系统养殖，养殖条件为水温28.5 ℃、pH 7～8 和14 h 光/10 h 暗的光照周期。收集受精卵：前1 天的傍晚将性成熟的斑马鱼按1∶1 性别比放入交配盒中，并用挡板将雌雄鱼分开；次日上午取出挡板，并在20 min 内收集刚受精的胚胎（1-cell 期）用于显微注射。

1.2 Cbsb 序列保守性分析 从国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）数据库中获取人（序列号：AAA98524.1）、小鼠（序列号：AAH13480.1）、大鼠（序列号：AAB02042.1）、斑马鱼（序列号：AAW78657.1）的CBS 的蛋白序列，利用ClustalX软件分析CBS 的同源性，并利用NCBI-Blast 分析CBS的保守结构域。

1.3 敲除靶点设计 使用成簇的规律性间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9 系统建立斑马鱼基因敲除品系：利用ChopChop 网站（http://chopchop.cbu.uib.no/）在线设计斑马鱼cbsb 的CRISPR/Cas9 敲除靶点，选择位于第4、第5 和第6 个外显子中的4 个向导RNA（guide RNA，gNRA）靶点，用于后续测试并筛选有效的切割靶点。为了验证上述设计的靶点序列在AB/WT斑马鱼基因组中的正确性，从Ensembl 数据库中获取这4 个靶点处的基因组序列，根据NCBI Primer-Blast设计扩增引物；采用PCR 法从AB/WT 斑马鱼基因组中扩增中这4 个靶点处的基因组序列，测序，验证基因组中实际的靶点序列。引物序列见表1。

表1 斑马鱼cbsb 的引物

1.4 Cas9 mRNA 和gRNA 制备 根据T7 mMESSAGE Ultra®试剂盒（Ambion，美国，批号：AM1345）方法体外转录斑马鱼中密码子优化的Cas9 mRNA（体外转录质粒模板由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心感觉整合与行为研究组的斑马鱼研究平台提供），并测定浓度；加入gRNA 靶点序列和T7 启动子，使用PCR 法（扩增质粒模板由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心感觉整合与行为研究组的斑马鱼研究平台提供）制备gRNA 合成的DNA 模板，根据MAXIscript®T7 试剂盒（Ambion，美国，批号：AM1312）方法体外转录为gRNA；根据mirVana™miRNA Isolation试剂盒（Ambion，美国，批号：AM1561）方法回收和纯化gRNA，并测定浓度。

1.5 显微注射及gRNA 切割效率检测 将Cas9 mRNA（400 mg/L）和gRNA（100 mg/L）混合物导入拉制好的显微注射玻璃电极中，通过显微注射仪（PICOSPRITZER®Ⅲ，Parker，美国；注射参数为30 psi，200 ms）将1 nL 的RNA 混合物注入1-cell 期细胞的动物极中。使用Hanks 溶液培养（根据Zebrafish Book 配置），并在3 d 后选取20 枚正常发育的胚胎提取基因组，使用对应的检测靶点序列的引物扩增靶点处基因组序列并测序，引物序列见表1。如果测序结果中发现靶点处出现乱峰，说明基因组该靶点处有切割，进一步将PCR 产物做T-A 克隆，多个克隆的测序结果与AB/WT 基因组序列比较，通过统计序列不一致的克隆数量计算靶点切割效率。

1.6 稳定品系筛选和鉴定 将注射Cas9 mRNA和gRNA混合物的胚胎养殖至成年（F0 代），并与AB/WT 成年斑马鱼外交，收集子代胚胎，并选取20 枚3 d 龄子代斑马鱼基因组扩增靶点处序列，通过测序检测靶点处是否出现乱峰，出现乱峰的亲本斑马鱼为敲除Founder。进一步将出现乱峰的PCR 产物做T-A 克隆，测序分析后将发生移码突变的Founder 于AB/WT 外交并养殖F1代。F1 代成年后通过剪尾提取基因组，通过PCR 和测序筛选cbsb 有移码突变的斑马鱼，含有移码突变的F1代斑马鱼进一步外交养殖，同样方法剪尾筛选获得F2代稳定敲除品系的杂合子。将F2 代杂合子内交可有1/4 的概率获得cbsb 敲除的纯合子。

2 结果

2.1 斑马鱼Cbsb 保守性分析 ClustalX 和NCBI-Blast比对序列发现，斑马鱼Cbsb 序列与人的CBS 序列一致性为76.32%，与小鼠的CBS 序列一致性为74.69%，与大鼠的CBS 序列一致性为75.94%。与哺乳动物相似，斑马鱼Cbsb 中间同样含有一个保守CBS 结构域，见图1。可见CBS 在包含斑马鱼在内的脊椎动物中都非常保守，在该保守结构域的编码序列处设计敲除靶点将会有效破坏该基因产物的正常功能。

图1 斑马鱼Cbsb 同源性分析

2.2 gRNA 靶点设计及合成 利用ChopChop 在线设计斑马鱼cbsb 的敲除靶点，4 个靶点均位于Cbsb 保守结构域编码序列的上游，其中靶点1#位于第4 个外显子上，靶点2#位于第5 个外显子上，靶点3#和4#位于第6 个外显子上。以AB/WT 斑马鱼基因组为PCR 模板，使用表1 引物序列扩增，测序发现AB/WT 斑马鱼基因组中包含与设计靶点一致的序列，见图2A。扩增获得约120 bps 的PCR 产物，即为gRNA 转录的DNA 模板，见图2B。使用体外转录试剂盒转录gRNA 并回收，获得的gRNA 的浓度分别为209、290、331 和222 mg/L。

图2 gRNA 靶点基因组序列测序验证及其体外转录gRNA 的模板制备（A：基因组测序结果与设计的gRNA 靶点序列比对；B：gRNA 模板电泳图）

2.3 检测靶点的切割效率 将体外转录的Cas9 mRNA 分别和gRNA 混合，注入1-cell 期细胞的动物极中，并获得注射过的胚胎约100 枚，培养3 d。每组取20 条左右发育正常的幼鱼，提取基因组并测序。结果发现4#靶点gRNA 的斑马鱼胚胎基因组中该位点的序列出现乱峰，其余靶点未发现乱峰，表明4#靶点被Cas9/gRNA 混合物切割，见图3A。T-A 克隆并测序，序列分析表明4#靶点处基因组序列被切割，切割效率为33.33%（5/15），见图3B。上述结果表明设计的gRNA 4#可高效切割斑马鱼cbsb 中对应的基因组上靶点，可通过该靶点来制备斑马鱼cbsb 敲除品系。

图3 不同gRNA 注射后检测基因组切割效率（A：注射Cas9/gRNA 混合物后幼鱼基因组测序结果与设计的gRNA 序列比对；B：4#靶点序列改变及切割效率）

2.4 F0 代养殖和Founder 筛选 从gRNA 4#注射后的剩余胚胎中取40 条正常发育的幼鱼继续培养至F0 代性成熟，优先使用F0 代雄鱼外交；取20 条子代幼鱼的混合基因组进行PCR 扩增并测序，选取在靶点处出现乱峰的样本，即为Founder。首批共9 条雄鱼外交，筛选后发现其中7 条出现乱峰，暗示该位点切割后产生的插入/删除序列遗传至下一代斑马鱼，见图4。其中Founder 5#、10#、12#和13#在靶点处出现显著乱峰，推测这些Founder 子代中出现cbsb 破坏的斑马鱼概率较高。选择Founder 5#和10#的子代幼鱼进一步养殖，以筛选稳定的cbsb 敲除杂合子品系。

图4 F0 子代幼鱼基因组测序筛选cbsb 敲除Founder

2.5 F1 代鉴定及稳定品系传代 剪尾筛选发现，25条Founder 5#和10#的成年子代（F1 代）中，17条基因组该位点都出现乱峰，进一步分析峰图和乱峰起始位置可见，F1代含有3种不同的基因组改变方式，见图5A；对这些F1 代斑马鱼的PCR 产物克隆后测序，鉴定确认为-8 bp、-3+13 bps 和-228 bps 处基因组改变，见图5B。选择-3+13 bps 和-228 bps 的两种子代传代，得到-3+13 bps 改变的稳定品系，命名为Ko（cbsb）a，-228 bps改变的稳定品系，命名为Ko（cbsb）b。将这两种品系各自内交并养殖F2 代，剪尾测序筛选并验证基因组序列，结果发现该位点突变可稳定遗传，即可获得cbsb 敲除斑马鱼的纯合子，见图5C。序列分析表明，Ko（cbsb）a品系可产生长为285 个氨基酸的Cbsb 截断产物，Ko（cbsb）b品系整个6#外显子几乎全部删除，其转录本出现移码突变，产生长为216 个氨基酸的Cbsb 截断产物，见图5D。

图5 稳定cbsb 敲除品系筛选和鉴定（A：F1 代剪尾测序筛选cbsb 敲除杂合子；B：F1 代T-A 克隆并测序确认基因组改变方式；C：F2 代剪尾测序鉴定cbsb 敲除纯合子；D：编码序列分析稳定cbsb 敲除品系产生截断的Cbsb）

3 讨论

对人类遗传疾病的研究发现，Cbs 的突变与胱硫醚尿症相关，临床表现为眼、骨骼、大脑、血管等组织的病变[11-12]。在小鼠模型中，敲除Cbs 导致小鼠血浆中同型半胱氨酸水平上升为正常小鼠的40 倍，并导致严重的生长迟缓表型，多数模型小鼠在出生后5 周内死亡。这些结果表明小鼠完全缺乏CBS 可导致严重同型半胱氨酸血症[13]。

血浆中同型半胱氨酸水平升高被认为是心血管相关疾病的危险因素。研究发现Cbs 敲除小鼠表现出明显的高血压和血管舒张性降低，提示H2S 是一种生理性血管扩张剂和血压调节剂[13]。Cbs 敲除的老年小鼠中，主动脉环对乙酰胆碱的舒张选择性受损，血栓调节蛋白抗凝血活性降低[14]，其肺部的血管生长也显著降低[15]。同时敲除Cbs 和apolipoprotein E 则导致无饮食诱导下的动脉粥样硬化的发生[16]。敲除Cbs 还会导致高血压以及血管的不良重塑[17-18]。可见CBS 对于血管的正常生长和功能起到了重要作用。

CBS 还在其它多种生理和病理过程中发挥作用。如Cbs 敲除小鼠表现出贫血，血清、肝脏、脾脏和心脏中的铁含量显著增加，肝脏严重受损，出现血色素沉着症样表型，表明CBS 参与了体内的铁离子稳态[19]。斑马鱼发育模型中，cbsb 瞬时敲降会导致部分胚胎出现体轴弯曲，暗示其可能在体轴发育中也发挥关键的作用[20]。在小鼠炎症模型中，敲除小胶质细胞的Cbs可导致炎症和神经元凋亡增加，而过表达Cbs 降低了炎症及其相关因子的表达水平，表明其对免疫系统也有调节作用[7]。另外，Cbs 在肾脏系统、肝脏系统、生殖系统、骨骼系统、神经系统、红细胞生成、肿瘤发生等中发挥特定的功能[12，21-24]。可见CBS 涉及的功能十分广泛。

CRISPR 是原核生物所特有的一种抵御外源性遗传物质的免疫系统，CRISPR/Cas9 基因编辑技术被广泛应用于斑马鱼基因敲除品系建立。本研究基于CBS在斑马鱼中的保守性，使用CRISPR/Cas9 建立了斑马鱼cbsb 敲除模型。本研究通过测序和精细序列分析来检测敲降效率、筛选稳定品系、鉴定杂合子/纯合子等，减少了技术环节，简化了敲除品系方法和流程，为后续斑马鱼敲除品系的制备和传代提供借鉴的方法。本研究成功构建的cbsb 敲除稳定品系可与现有的斑马鱼多种荧光标记品系（如血管内皮细胞、神经细胞、心肌细胞、肾脏细胞等）杂交，从而获得cbsb 稳定敲除且具荧光标记的模型，借助斑马鱼活体成像技术和高通量技术的优势，为进一步研究cbsb 在生理和病理过程中的精细功能提供基础。