新疆地区230例苯丙氨酸羟化酶缺乏症患儿基因突变分析*

刘昱彤,冯子奕,薛淑媛,3△

1.新疆医科大学公共卫生学院,新疆乌鲁木齐 830011;2.乌鲁木齐市妇幼保健院产前诊断中心,新疆乌鲁木齐 830000;3.西北大学生命科学学院,陕西西安 710069

高苯丙氨酸血症(HPA)属于新生儿出生缺陷的一种,其病因是编码苯丙氨酸羟化酶(PAH)或其辅酶四氢生物蝶呤(BH4)缺陷,导致血苯丙氨酸(Phe)在患儿肝脏中无法正常代谢。血液中堆积过量的Phe和旁路代谢产物产生的神经毒性作用会导致患儿逐渐发生不可逆的发育迟缓、智力障碍、癫痫和异常行为[1]。根据血Phe水平,将PAH缺乏症分为经典型苯丙酮尿症(PKU)、轻度PKU及轻度HPA[2]。PAH缺乏症目前已成为我国新生儿遗传代谢病中患病率最高的疾病[3]。对于此类疾病,临床上已可防可治可控,治疗方案因表型的不同而有所不同,经典型PKU与轻度PKU患儿需要使用特殊食品进行治疗,而轻度HPA只需定期随访监测血Phe水平[1],因此明确HPA的分类不仅对精准治疗至关重要,而且可以预测出生后的饮食方案并缓解患儿家长的心理压力。本研究通过分析新疆地区230例PAH缺乏症患儿的PAH基因变异情况,构建新疆地区PAH基因变异谱。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2015年1月1日至2023年2月28日于新疆乌鲁木齐市妇幼保健院确诊的230例PAH缺乏症患儿纳入研究,患儿均为出生满72 h的新生儿,男121例、女109例,排除BH4缺乏症、早产患儿、静脉输入营养液所致的暂时性HPA及肝功能异常和其他遗传代谢性疾病等导致的继发性HPA。患儿监护人对本研究知情同意并签署知情同意书。本研究经乌鲁木齐市妇幼保健院医学伦理委员会批准(XJFYLL2019035)。

1.2方法

1.2.1筛查方法 对出生满72 h并充分哺乳6～8次的新生儿,用75%乙醇消毒后使用一次性采血针刺于足跟内或外侧,深度<3 mm,弃去第1滴血,采集4个直径>8 mm的血斑,自然晾干,置4～8 ℃保存。采用荧光法及串联质谱法进行血Phe水平及Phe与酪氨酸(Tyr)比值(Phe/Tyr)测定,初筛及复查血Phe水平>120 μmol/L(2.0 mg/dL)为阳性。将筛查阳性者召回并采血,若血Phe水平仍>120 μmol/L则进行尿蝶呤谱分析以区分PAH缺乏症和BH4缺乏症。

1.2.2诊断标准 参考《高苯丙氨酸血症的诊治共识》[2],根据血Phe水平对BH4的治疗反应分为BH4反应性和BH4无反应性PAH缺乏症。经BH4负荷后,任意时间点血Phe水平较负荷前基础值下降≥30%者为BH4反应性PAH缺乏症,<30%者为BH4无反应性PAH缺乏症。通常根据治疗前的血Phe最高水平或摄入足够天然蛋白质情况下的血Phe水平,将PAH缺乏症分为经典型PKU:血Phe水平≥1 200 μmol/L;轻度PKU:血Phe水平为360～1 200 μmol/L;轻度HPA:血Phe水平为120～<360 μmol/L。

1.2.3PAH基因分析 用EDTA抗凝管抽取患儿及父母的外周静脉血2～3 mL,磁珠法提取 DNA,提取物质控达标后,进行文库构建,应用高通量测序技术对PAH的相关基因进行直接测序。在BIOPKU数据库和HGMD数据库将变异位点输入进行查阅。检测到的全部变异位点按照ACMG指南进行致病性分析。使用生物信息学软件MutationTaster、SIFT、PolyPhen_2对变异基因蛋白功能的致病性进行预测。对发现的致病突变进行PCR扩增及Sanger测序,验证高通量测序的结果,并对患儿父母采用Sanger法进行目标基因突变验证。

1.3统计学处理 采用SPSS25.0统计软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示,组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同表型PAH缺乏症患儿的一般资料 纳入研究的230例PAH缺乏症患儿中,经典型PKU 42例(18.26%),其中男25例、女17例,治疗前血Phe平均水平为2 048.19 μmol/L;轻度PKU 22例(9.65%),其中男15例、女7例,治疗前血Phe平均水平为660.49 μmol/L;轻度HPA 166例(72.17%),其中男81例、女85例,治疗前血Phe平均水平为180.12 μmol/L。见表1。

表1 不同表型PAH缺乏症患儿的一般资料

2.2PAH基因变异情况 230例PAH缺乏症患儿的460个等位基因位点中,共检出441个PAH基因变异位点,总检出率为95.87%,其中,227例患儿检测到2个变异位点,2例患儿仅检测到1个变异位点,1例患儿检测到3个变异位点;复合杂合变异217例,纯合变异10例。涉及91种PAH基因变异,包含错义突变[84.81%(374/441)]、无义突变[7.26%(32/441)]、剪接突变[4.99%(22/441)]和移码突变[2.95%(13/441)]。变异位点分布在外显子2至外显子12,内含子2、内含子4、内含子7、内含子8,内含子10至内含子13;高频分布在外显子2[24.04%(106/441)]和外显子7[23.13%(102/441)],高频分布合计占比47.17%,见图1。

PAH基因变异频率由高到低依次为c.158G>A[23.39%(102/441)]、c.728G>A[11.70%(51/441)]、c.688G>A[5.05%(22/441)]、c.721C>T[3.90%(17/441)]、c.611A>G[3.67%(16/441)]、c.1238G>C[3.21%(14/441)],以上PAH变异总占比为50.92%。见表2。

表2 新疆地区PKU患者PAH基因变异情况

2.3三种不同表型患儿的PAH基因变异位点分析 PAH缺乏症的基因型在人群中的分布有所不同,代谢表型也有很大差别。本研究将新疆地区PAH基因变异频率较高的18种类型进行统计分析后得出,c.158G>A、c.728G>A、c.688G>A、c.721C>T、c.1068C>A、c.1301C>A、c.331C>T和c.782G>A共8种突变的频率在PAH缺乏症不同表型之间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

经典型PKU患儿的主要变异位点为c.728G>A、c.331C>T和c.782G>A;轻度PKU患儿的主要变异位点为c.721C>T、c.1068C>A和c.1301C>A;轻度HPA患儿的主要变异位点为c.158G>A和c.688G>A。5种变异位点仅在轻度HPA中被检出,分别为c.158G>A、c.688G>A、c.1174T>A、c.320A>G和c.1139C>T。见表3。

表3 新疆地区常见PAH基因变异位点在不同表型中的分布[n(%)]

2.4特殊案例分析 本研究中发现1例特殊案例,先证者为1名回族男性,出生体重3 310 g,初筛血Phe水平为559.2 μmol/L,复筛血Phe水平为1 858.0 μmol/L,临床诊断为经典型PKU。检出c.1222C>T和c.838G>A的杂合突变,Sanger家系验证报告显示,先证者c.1222C>T位点变异遗传自母亲,但先证者的父、母c.838G>A位点均为野生纯合子,c.838G>A可能为先证者新发突变。见图2～4。

图2 患儿Sanger测序验证图谱

图3 患儿父亲Sanger测序验证图谱

图4 患儿母亲Sanger测序验证图谱

3 讨 论

HPA是由于PAH或BH4缺乏所引起的单基因隐性遗传病[4],目前已明确相关致病基因有6种,分别为PAH、GCH1、PTS、SPR、PCBD、QDPR和DNAJC12[5-6]。不同民族或地域间PAH基因高频变异位点的差异性使PAH缺乏症成为一种具有极强遗传异质性的谱系疾病。本研究通过分析新疆地区PAH缺乏症基因变异类型,初步评估基因型与表型的相关性,为表型预测提供一定依据,有助于新生儿HPA的管理及预后评估。

本研究回顾性分析了230例PAH缺乏症PAH基因的变异类型,点突变以错义突变(84.81%)为主,与既往研究基本一致[7],其次为无义突变(7.26%)、剪接突变(4.99%)和移码突变(2.95%)。突变位点集中分布在外显子2和外显子7上,分别占24.04%和23.13%,欧洲PAH基因高频变异区域集中在外显子12和内含子11上,中国PAH基因高频变异区域集中在外显子3至外显子7和外显子10至外显子12[7],说明PAH基因变异位点的分布既存在种族、地域的差异性又具有相似性。

本研究的新疆地区230例PAH缺乏症患儿中,最常见的PAH基因变异位点为c.158G>A(23.39%)、c.728G>A(11.70%)、c.688G>A(5.05%)、c.721C>T(3.90%)、c.611A>G(3.67%)、c.1238G>C(3.21%)。西北地区PAH基因变异高频位点为c.728G>A(14.00%)、c.611A>G(5.58%)、c.1068C>A(4.95%)、c.1238G>C(4.74%)、c.442-1G>A(4.32%)、c.1197A>T(4.11%)和c.721C>T(4.11%)[8],与本研究常见变异位点相似,但排序不同,本研究PAH基因变异频率最高的为c.158G>A(23.39%),与青岛[9]和石家庄[10]的研究报道一致。新疆地区幅员辽阔、民族众多,不同民族有其独特的PAH基因变异谱,而且地区之间存在差异。SU等[11]的研究显示,新疆南部地区少数民族患儿常见的PAH基因变异位点为c.311C>A(8.41%)和c.1238G>C(7.96%),但本研究中c.311C>A(0.46%)和c.1238G>C(3.21%)检出率较低,可能与新疆南北部少数民族构成比不同有关。与何江等[12]的71例新疆地区PAH基因检测结果比较后发现,c.728G>A、c.158G>A与c.611A>G是新疆地区普遍存在的PAH基因高频变异位点,但本研究中c.688G>A与c.1174T>A检出率较高,原因可能为本研究中包含民族较全面,样本量较大。在既往新疆地区研究中c.688G>A作为PAH基因高频位点未被报道过,有此变异位点者在本研究的少数民族患儿中占比较多,其中1例患儿父母为近亲结婚。以上研究结果表明,新疆地区PAH基因变异谱存在地区分布和民族差异,提示c.688G>A和c.1174T>A可能是新疆地区特有变异位点。

研究显示,全球表型分布情况为经典型PKU占62%,轻度PKU占22%,轻度HPA占16%;中国的分布情况为经典型PKU占62.1%,轻度PKU占27.6%,轻度HPA占10.3%[7]。我国各地PAH缺乏症的表型分布不一,福建省经典型PKU占15.05%,轻度PKU占21.51%,轻度HPA占63.44%[13];浙江省经典型PKU占43.57%,轻度PKU占33.10%,轻度HPA占23.33%[14]。本研究结果中,新疆地区经典型PKU占18.26%,轻度PKU占9.65%,轻度HPA占72.17%,新疆地区轻度HPA占比明显高于其他地区。

PAH缺乏症的基因型与表型存在密切联系,在世界各地的分布具有异质性[15-17]。不同表型PAH缺乏症患儿的PAH基因变异的高频位点不同,本研究首次分析了新疆地区基因型与表型的相关性,研究结果显示,经典型PKU主要高频变异为c.728G>A、c.331C>T和c.782G>A。c.158G>A、c.688G>A;轻度PKU高频变异为c.721C>T、c.1068C>A和c.1301C>A;轻度HPA高频变异为c.158G>A和c.688G>A;3种表型的高频变异有明显差异。此外,c.1174T>A、c.320A>G和c.1139C>T均只在轻度HPA患儿中检出,证明以上变异与轻度HPA存在一定关联。甘肃[18]和重庆部分地区[19]的研究均显示c.728G>A与轻度PKU及经典型PKU相关,而本研究中c.728G>A在经典型PKU患儿中检出频率最高,在轻度PKU患儿中检出c.728G>A的频率低于轻度HPA患儿。

本研究中c.158G>A变异频率为23.39%,是新疆地区最常见的变异位点,而且仅在轻度HPA患儿中被检出,可作为新疆地区轻度HPA患儿的标志性变异位点。有研究表明,HPA的致病性与患儿体内酶活性高低有关[20],c.158G>A变异导致患儿体内酶活性降低,残余酶活性降低为正常酶活性的79%,患儿仍有一定Phe代谢能力[21],因此临床上症状较轻,多为轻度HPA,但当c.158G>A与不同PAH基因变异位点组合为复合杂合状态时,可引起临床表型发生改变。新疆地区的经典型PKU、轻度PKU及轻度HPA患儿具有独特基因型,分析基因型与表型之间的关联性,对不同的PAH基因变异对酶活性的影响进行更为深入的功能研究与随访,可以提供更全面的遗传学信息。

综上所述,本研究通过分析新疆地区230例PAH缺乏症患儿的PAH基因,构建新疆地区的PAH基因变异谱发现新疆地区以轻度HPA患儿为主,多为复合杂合突变,高频变异位点为c.158G>A、c.728G>A、c.688G>A、c.721C>T、c.611A>G和c.1238G>C。明确了3种不同表型的高频变异位点,在经典型PKU、轻度PKU和轻度HPA患儿中均观察到具有特异性的PAH基因型,基因型与表型数据的结合将有助于临床医生快速明确疾病类型,更好地改善患儿预后,为精准产前诊断提供理论依据。