实时荧光PCR 检测在支原体肺炎诊断中的应用价值分析

梁洁琼，黄雪萍，胡斌，宁梅芳

1.来宾市人民医院医学检验科，广西来宾 546100；2.来宾市人民医院儿科，广西来宾 546100

支原体肺炎是由支原体感染引起的疾病，作为儿童最常见的呼吸系统疾病之一[1]。支原体肺炎感染人体后经过2～3 周潜伏期，此时在临床表现为干咳、发热、咽痛、头痛等，甚至部分患儿无明显症状，且该病可通过飞沫和直接接触传播，因此易在人群密集环境中发生[2]。统计显示，近年随着空气环境、饮食习惯等的变化，该病发生率持续升高，若未及时治疗可引起脑膜炎等并发症，严重威胁患儿身心健康状态[3]。既往针对支原体肺炎以血清中检测出的支原体抗体为主要依据，但经血清免疫学研究发现，支原体等微生物进入人体后需要一定时间引起免疫应答继而产生抗体，因此血清支原体抗体在支原体感染诊断中存在一定漏诊[4]。近年随着医疗技术的发展及临床对分子生物学研究的不断深入，实时实时荧光聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术被广泛应用于临床，为深入分析该方案在支原体肺炎诊断中的价值，本文选取2022 年8 月—2023 年10 月来宾市人民医院收治的1 200 例疑似支原体肺炎患儿为研究对象，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院收治的1 200 例疑似支原体肺炎患儿为研究对象，分别采集其血清和呼吸道分泌物，用化学发光法测定血清中肺炎支原体抗体，用实时荧光PCR 法检测呼吸道分泌物中的肺炎支原体核酸（Mycoplasma Pneumoniae Nucleic Acid，MP-DNA）。统计发现1 200例患儿中男684例，女516例；年龄1～12岁，平均（5.14±0.82）岁；入院原因：发热841例，干咳197 例，头痛162 例；症状出现时间1～22 d，平均（10.41±1.42）d。本研究上报医院医学伦理委员会并获得审批。同时经患儿家属知情同意（LW2023-02）。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①存在干咳、发热、咽痛、头痛等症状，且符合《儿童社区获得性肺炎管理指南》中相关诊断标准[5]；②年龄1～12 岁；③临床各项资料齐全；④本研究患儿家属知情，并签署知情同意书；⑤未采取免疫抑制剂或免疫增强药物治疗；⑥无脏器组织损伤；⑦急性期及恢复期双份血清抗体滴度呈4倍及以上升高；⑧入院24 h 内支原体抗体（Mycoplasma Antibody）MP-Ab≥1∶160。

排除标准：①自愿退出本次研究者；②入院前2周使用阿奇霉素等大环内酯类抗生素治疗者；③入院后治疗中出现严重不良反应者；④病历资料不完善者；⑤混合病原菌感染者；⑥未按要求完成随访者；⑦先天性免疫缺陷者；⑧营养不良者。

1.3 方法

1 200 例患儿均采集其血清和呼吸道分泌物，用化学发光法测定血清中肺炎支原体抗体，用实时荧光PCR 法检测呼吸道分泌物中的MP-DNA，在实施检查前为患儿及其家属讲解具体检查流程、注意事项等，同时告知其标本采集过程中注意事项，确保其积极配合。

MP 血清学方法检测：血清标本采集患儿的静脉全血2～3 mL 于无菌生化管中，并分离出血清待检，化学发光法肺炎支原体抗体检测试剂盒由亚辉龙生物科技股份有限公司提供，仪器使用亚辉龙ICERSiFlash 3000-C 化学发光测定仪，检测结果判定：抗肺炎支原体IGM 抗体（Anti Mycoplasma Pneumoniae IGM, MP-IGM）结果在0.9～1.1 coI 时，为可疑感染；MP-IGM 结果＞1.1 coI 时，为阳性，提示患儿处于肺炎支原体急性感染期。

实时荧光PCR 检测：标本采集要求为鼻咽拭子（双拭子）：用一次性鼻拭子经由患儿鼻腔轻轻旋转一周，将采集好的拭子头垂直插入标本采集管中，同时用一次性咽拭子经由患儿的咽喉后壁、扁桃体侧壁等处反复擦拭2～3 次，将采集好的拭子头垂直插入同一标本采集管中密封待检。荧光PCR 法肺炎支原体核酸检测试剂盒由圣湘生物科技股份有限公司提供，本试剂盒的最低检测下限为500.0 copies/mL；仪器为上海宏石SLAN-96P 实时荧光定量PCR 仪，扩增条件设置为50℃，30 min，1 个循环，95℃，1 min，1 个循环，95 ℃，15 s、60 ℃，30 s、45 个循环，25℃，10 s，1 个循环，荧光通道选择FAM 、VIC 通道。阳性结果：动力学曲线呈“S”型，FAM 通道Ct 值≤40，且VIC（内标通道）≤40；阴性结果：FAM通道Ct 值＞40， VIC（内标通道）动力学曲线呈“S”型，且VIC（内标通道）Ct 值≤40；对于阳性标本，内标检测结果不作要求；对于阴性样本，其内标检测应为阳性（Ct 值≤40），若其内标Ct 值＞40 或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本重新采样，进行重复试验。

1.4 观察指标

1.4.1 诊断结果 以病原学检查结果为金标准，分析各个方案结果。

1.4.2 诊断效能 分析各个方案诊断效能，灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%，特异度=真阴性例数/（假阳性例数+真阴性例数）×100%，阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%，阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%。准确度=（真阳性例数+真阴性例数）/总例数×100%。

1.5 统计方法

以SPSS 23.0 统计学软件分析数据，计数资料（诊断效能值）采用例数（n）和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法诊断结果对比

以病原学检查结果为金标准，支原体肺炎阳性939 例，阴性261 例。见表1。

表1 两种方法诊断结果对比（n）

2.2 两种方法诊断效能对比

实时荧光PCR 检测灵敏度（99.36%）、特异度（98.08%）、准确率（99.08%）、阳性预测值（99.36%）、阴性预测值（98.08%）高于MP 血清学方法检测，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表2。

表2 两种方法诊断效能对比（%）

3 讨论

支原体肺炎是除病毒、细菌外极易引起儿童肺炎的常见病原体，在全球范围内每年均有支原体肺炎感染病例报告，且呈现持续、散发或不定期的特征。支原体肺炎的传染率较高，多在中小学、幼儿园等相对封闭的场所暴发，加之该病无特异性症状，多表现为发热、咳嗽、咳痰等，因此，漏误诊率较高，若未及时控制随着病情加重可诱发肺外感染、心力衰竭、全身炎症反应等，威胁患儿生命[6-9]。

肺炎支原体缺乏细胞壁，用针对抑制细胞壁合成发挥抗菌作用的头孢菌素类、β 内酰胺类抗生素治疗支原体肺炎是无效的，而大环内酯类抗生素的抗菌机制是控制细胞内蛋白质的合成，因此大环内酯类抗生素治疗支原体肺炎效果理想，故及早实施诊断对制订治疗方案有重要作用[10-11]。

本研究显示，实时荧光PCR 检测在支原体肺炎诊断中效果理想[11]。MP 血清学方法具有操作简单、速度快等特点，但其灵敏度、特异度较低，极易出现假阳性的情况。实时荧光PCR 检测技术是一种新兴的体外核酸扩增技术，可同时扩增多个标本，直接反映患儿的感染情况，该方法可通过探针实时监测扩增时的荧光信号，不必进行电泳等操作，可缩短检测所需时间，同时可提高诊断准确率，但需要注意该方案对样本采集和操作环境要求较高，若样本处理出现差错可直接影响诊断结果，增加诊断难度，因此临床需要对操作人员综合能力进行培养[12-15]。

本研究显示，实时荧光PCR 检测灵敏度（99.36%）、特异度（98.08%）、准确度（99.08%）、阳性预测值（99.36%）、阴性预测值（98.08%）高于MP 血清学方法检测，差异有统计学意义（P＜0.05），该结果与王晶等[16]研究中RTFQ-PCR 诊断灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为90.48%、93.02%、95.00%、89.96%，这一结果接近，可见支原体肺炎诊断中应用实时荧光PCR 检测可行性较高，究其原因在于实时荧光PCR 检测是唯一一个将基因拷贝数进行定量的方法，且检验操作较为智能，可减少人工误差；其次该方案特异度、灵敏度较高，将DNA 杂交的高特异性和光谱技术的高精准性融合，应用荧光探针和光电传导，直接探测基因扩增过程中荧光信号的变化，以获得定量结果，相当于在PCR 反应过程中自动完成了Northern 杂交，杜绝了传统PCR 开放检测对环境的污染和由此导致的假阳性，提高诊断准确率[17]。

综上所述，实时荧光PCR 检测在支原体肺炎诊断中的应用价值较高，临床医师可结合诊断结果制定合理的干预方案，达到控制病情改善预后的目的。