探针熔解曲线在耐药结核病快速筛查中的临床应用研究

宋戎，缪家文，孙春红，朱亮，王捷婷

镇江市第三人民医院检验科，江苏镇江 212000

结核病属于传染性疾病，也是危害人类生命健康的严重致死性疾病，尤其是耐药结核病[1]。2019 年世界卫生组织报告显示，全球新发结核病1 060 万，中国排第三，新发结核病78.0 万[2]。新发结核病患者中，有一半以上属于新发耐多药结核病[3-4]。早期确诊结核病，及时发现耐药结核病，制订并实施科学有效治疗，是控制病情，改变生存结局的唯一方案[5-7]。为提高结核病治疗效果，需在确诊后尽早通过相关方法进行检测，明确结核病患者的各种药物耐药情况，为临床科学、合理用药提供详细、全面信息，指导临床用药，提高结核病治疗效果。本研究选取2020 年1月—2021 年3 月镇江市第三人民医院检验科收治的378 例肺结核患者为研究对象，分析探针熔解曲线在耐药结核病快速筛查中的临床应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院检验科收治的378 例肺结核患者为研究对象。男223 例，女155 例；年龄20～76 岁，平均（48.35±4.72）岁；病程1～15 年，平均（8.34±1.28）年。本研究经医学伦理委员会审核批准（2023-37-01），患者及家属知情同意。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：资料完整详细；配合完成检查；精神状态正常。

排除标准：检查不配合的患者；提供样本污染的患者；不配合本研究的患者。

1.3 方法

1.3.1 仪器及试剂 广东体必康 BACspreader 1100C细菌超声分散计数仪、结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis, MTB）核酸提取试剂盒、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）熔解曲线法耐药突变检测试剂盒、厦门致善Lab-Aid 824s 磁珠法核酸自动提取仪与配套荧光定量PCR 检测系统、珠海贝索罗氏培养基、二级生物安全柜等。

1.3.2 检测方法 比例法：严格遵循《结核病实验室检验规程》中的要求完成罗氏固体药物敏感性检测。探针熔解曲线检测技术：严格遵循厦门致善荧光PCR 熔解曲线法检测结核分枝杆菌对药物检测试剂说明书操作及结果进行判断，若是痰标本则通过Lab-Aid 824s 磁珠法核酸自动提取仪完成纯化MTB DNA 提取工作，在PCR 反应管添加标记有荧光基团及淬灭基团的特异性寡核苷酸探针，于PCR扩增期间进行荧光值实时监测，结合靶序列熔点变化判断是否为野生株或耐药突变。

1.4 观察指标

以比例法为金标准，计算熔解曲线技术检测的敏感度[真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%]、特异度[真阴性例数/（假阳性例数+真阴性例数）×100%]、阳性预测值[真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%]、阴性预测值[真阴性例数/（假阴性例数+真阴性例数）×100%]、符合率[（真阳性例数+假阴性例数）/（真阳性例数+假阴性例数+假阳性例数+真阴性例数）×100%]、约登指数（灵敏度+特异度-1），涉及药物6 种，是利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、氧氟沙星、阿米卡星。

1.5 统计方法

应用SPSS 18.0 统计学软件进行分析，以传统的比例法（罗氏固体药物敏感性检测）作为金标准对照，计算荧光PCR 熔解曲线法技术检测6 种药物耐药的敏感性、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率、约登指数。

2 结果

与比例法比较，熔解曲线技术检测利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、氧氟沙星、阿米卡星耐药性的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率、约登指数见表1。

表1 溶解曲线技术检测6 种药物耐药结果

3 讨论

受人口流动性持续增大、人们生活观念及性观念改变等影响，结核病与艾滋病的流行趋势日益上升，防治形式更为严峻[8]。鉴于结核病危害性较大，需早期采用有效技术筛查疾病，及时发现结核病的存在，早期进行有效治疗[9]。世界卫生组织报道显示，中国属于耐药结核病高负担国家[10]。但传统结核病诊断、检测方法已经无法满足现今严峻的结核病防治形势，尤其是耐药结核病[11]。世界卫生组织的相关报告显示，异烟肼耐药结核患者的增长速度更明显[12]。针对这一情况临床推广应用GeneXpert MTB/RIF 检测，但该检测技术有限检测利福平耐药结核，用于异烟肼耐药结核筛查，存在一定的漏诊率，部分患者的病情容易耽误[13]。现今国内基层医院常用的耐药结核病筛查方法较多，包含表型检测方法、基因型检测方法。表型检测方法以传统比例法（罗氏固体药物敏感性检测方法）、液体法（全自动培养仪BACTEC MGIT 960 检测方法）为主，基因型检测方法以GeneXpert MTB/RIF 技术与基因芯片法等为主。若应用传统表型检测方法展开筛查工作，需进行结核分枝杆菌培养、药物敏感试验，具有较好的准确性、重复性，是现今诊断结核病的金标准方法，但对实验室生物安全级别有较高要求，且结核分枝杆菌的生长速度较慢，获取检测报告的时间较长，多在2～6 周出具报告，严重影响患者早期治疗。为达到快速检测耐药结核病的目的，临床医师将目光投入分子检测技术。

现今分子诊断方法较多，包含线性探针反向杂交法、实时荧光PCR 法以及探针熔解曲线法等[14]。探针熔解曲线法是现今比较推崇的方法，具有操作简单、便捷、快速、准确与经济等多项优点，可快速检测结核分枝杆菌的利福平及异烟肼等耐药突变基因，适合大批量样本筛查工作。但从临床应用可发现，现今探针熔解曲线技术主要用于利福平、异烟肼两种耐药结核病筛查种，但在乙胺丁醇以及链霉素耐药结核病筛查种的应用较少。朱玉梅等[15]的研究对耐药肺结核的多色探针熔解曲线分析技术价值展开分析，其中氧氟沙星的敏感度是87.0%、特异度是94.0%，认为该技术具有显著应用价值。本研究赞成上述观点，研究结果显示，应用探针熔解曲线技术检测后，利福平敏感度为91.70%、特异度为98.10%、符合率为97.90%，异烟肼敏感度为87.90%、特异度为94.20%、符合率为93.65%，乙胺丁醇敏感度为87.50%、特异度为97.03%、符合率为96.83%，链霉素敏感度为91.30%、特异度为98.19%、符合率为97.35%，氧氟沙星敏感度为94.74%、特异度为98.89%、符合率为98.68%，阿米卡星敏感度为80.00%、特异度为99.46%、符合率为99.21%，6 种药物耐药结核病的筛查敏感度、特异度与符合率均较高，可见该技术的应用价值显著。但在应用该检测法的时候，必须重视相关问题，部分痰标本中的MTB 含量比检测下限更低的时候，会导致标本表型药敏试验为耐药，但分子耐药显示敏感，导致测序结果不一致。

综上所述，探针熔解曲线在耐药结核病快速筛查中的临床应用效果显著。