高良姜素调节MCP-1/CCR2信号轴对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

秦婷婷 徐洋 杨璐瑜 洪帆 周涛 车瑾

肺癌是呼吸系统中的一类疾病,在全球中都是属于死亡率最高的癌症之一,而且随着人们的生活环境变化,其发病率在不断上升。而非小细胞肺癌属于肺癌中最高发的一类癌症[1-2]。目前临床上常采用化疗的方法治疗,但是会产生耐药而导致效果不佳[3]。因此,对肺癌发生发展的机制研究可能会发现治疗肺癌的其它有效途径。高良姜素,化学名称为3,5,7-三羟基黄酮,在高良姜和蜂蜜中存在,属于天然黄酮类化合物[4-5]。对于高良姜素的药理学研究显示,其具有降血脂、清除自由基、抗肿瘤以及抗氧化等作用,有研究已经显示高良姜素可以通过调控相关信号通路从而增强顺铂等化疗药物对于肺癌的治疗效果[6-7]。而对于细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)也经常被叫做趋化因子配体2(CC chemokine ligand 2,CCL2)。MCP-1的受体就是趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2,CCR2)。有研究报道,MCP-1可以与CCR2相互作用,进一步参与细胞凋亡、增殖等生理过程。MCP-1属于促炎性趋化因子,并且与癌症的预后有关,所以对MCP-1/CCR2信号通路的抑制就成为了新的肿瘤治疗策略[8-10]。而高良姜素能否通过调控MCP-1/CCR2信号通路对人肺癌细胞产生影响还未有研究。因此,本研究旨在探究高良姜素对人肺癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 人肺癌细胞系(A549)来自博辉生物科技(广州)有限公司。

1.2 主要试剂 高良姜素来自上海瓦兰生物科技有限公司;RPMI-1640细胞培养液购自爱必信(上海)生物科技有限公司;吉非替尼购自北京凯诗源生物科技有限公司;MCP-1来自上海鸿肽生物科技有限公司;细胞计数试剂盒购自厦门慧嘉生物科技有限公司;凋亡试剂盒购自上海伟进生物科技有限公司;胎牛血清购自北京博尔西科技有限公司;transwell小室来自北京沃凯生物科技有限公司;兔源一抗MCP-1、Caspase-3、GAPDH购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;兔源一抗CCR2、Ki67、MMP-2购自武汉益普生物科技有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 细胞培养 将人肺癌细胞A549接种在RPMI-1640完全培养基(含10%FBS、1%双抗)中并置于37℃、5% CO2的湿润培养箱中培养。待细胞生长至对数期后进行后续实验测定。

1.4 细胞分组以及细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测 将A549细胞以每孔2×105个细胞的浓度接种到96孔板中。培养24 h后,将细胞分为正常培养的ctrl组,以及分别用低浓度高良姜素(25 μmol/L)、高浓度高良姜素(100 μmol/L)[11]、吉非替尼(10 μmol/L)[12]、高浓度高良姜素+MCP-1(100 μmol/L高良姜素+ 75 ng/mL MCP-1)[13]进行孵育处理的细胞组,在培养箱中继续培养24 h以供后续实验使用。然后向每个孔中加入10 μL的CCK-8试剂。与细胞一起孵育2 h后,使用多功能酶标仪在450 nm处监测光密度值(吸光度/OD值)并处理分析。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将A549细胞用胰蛋白酶消化处理后,接种至6孔板(4×105个/mL)并培养48 h。按照1.4步骤的细胞分组并处理,然后根据试剂盒商家的说明,用FITC膜连蛋白V/碘化丙啶双重染色,通过流式细胞仪(BD FACSCalibur)检测细胞凋亡。FITC+/PI+和FITC+/PI-的细胞为凋亡细胞,最后分析处理细胞凋亡率。

1.6 细胞划痕实验检测细胞迁移 将A549细胞接种到6孔板中,等到细胞生长到融合状态,吸去培养基,用200 μL枪头尖刮去细胞。然后根据1.4中的分组以及浓度进行处理并孵育48 h,然后使用倒置显微镜监测细胞的迁移情况,计算划痕愈合率。

1.7 Transwell 检测细胞侵袭能力 首先将处于对数期生长的细胞重悬,备用。Matrigel基质胶稀释后,加到上室中,孵育4 h后,将重悬的A549细胞加入上室并加入1.4中的分组药物及相应的浓度,下室中加入含有10%FBS的培养液,在37℃环境中孵育48 h。然后用多聚甲醇固定细胞、结晶紫染色,然后用光学显微镜观察记录细胞侵袭数。

1.8 western blot检测MCP-1、CCR2、Caspase-3、Ki67、MMP-2蛋白表达 取上述1.4分别处理的A549细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解,再加入蛋白酶抑制剂,提取总蛋白。将蛋白质进行定量、电泳、转移到硝酸纤维素膜上、用脱脂乳封闭,然后将膜与一抗MCP-1(1∶1 000)、CCR2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、Ki67(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)在4℃下孵育过夜,然后将膜浸泡于HRP标记的二抗孵育液中2 h。加入ECL试剂检测观察免疫反应蛋白。使用Image Lab软件分析目标蛋白的灰度值。

2 结果

2.1 5组A549细胞增殖能力比较 与ctrl组相比,低浓度高良姜素组、高浓度高良姜素组、吉非替尼组的细胞存活率出现下降趋势(P<0.05);高浓度高良姜素组、吉非替尼组与低浓度高良姜素相比,细胞存活率有更加明显的降低(P<0.05);高浓度高良姜素+MCP-1组与高浓度高良姜素组比较,细胞存活率上升(P<0.05)。见表1。

表1 5组A549细胞存活率比较 n=5,%,

2.2 5组A549细胞凋亡比较 通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。低浓度高良姜素组、高浓度高良姜素组、吉非替尼组与ctrl组比较,A549细胞凋亡率升高(P<0.05);高浓度高良姜素组、吉非替尼组与低浓度高良姜素相比,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05);而高浓度高良姜素+MCP-1组与高浓度高良姜素组比较,细胞凋亡率又出现降低趋势(P<0.05)。见图1,表2。

图1 流式细胞术检测5组A549细胞凋亡水平

表2 5组A549细胞凋亡率比较 n=5,%,

2.3 5组A549细胞迁移能力比较 通过划痕实验测定细胞的迁移能力。低浓度高良姜素、高浓度高良姜素组、吉非替尼组的A549细胞划痕愈合率与ctrl组比较降低(P<0.05);高浓度高良姜素组、吉非替尼组与低浓度高良姜素相比,细胞划痕愈合率降低(P<0.05);与高浓度高良姜素组比较,高浓度高良姜素+MCP-1组A549细胞划痕愈合率升高(P<0.05)。见图2,表3。

图2 划痕实验检测A549细胞迁移(×100)

表3 5组A549细胞划痕愈合率比较 n=5,%,

2.4 5组A549细胞侵袭能力比较 通过Transwell实验测定细胞的侵袭能力。低浓度高良姜素、高浓度高良姜素组、吉非替尼组组的A549侵袭细胞数与ctrl组比较明显减少(P<0.05);高浓度高良姜素组、吉非替尼组与低浓度高良姜素相比,细胞侵袭数降低(P<0.05);与高浓度高良姜素组比较,高浓度高良姜素+MCP-1组A549细胞侵袭细胞数增加(P<0.05)。见图3,表4。

图3 Transwell实验检测A549细胞侵袭(结晶紫染色×200)

表4 5组A549细胞侵袭细胞数 n=5,个,

2.5 5组A549细胞中MCP-1、CCR2、Caspase-3、Ki67、MMP-2相关蛋白表达比较 与ctrl组比较,低浓度高良姜素组、高浓度高良姜素组、吉非替尼组的MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表达降低,Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05);高浓度高良姜素组、吉非替尼组与低浓度高良姜素相比,MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表达降低,Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05);与高浓度高良姜素组比较,高浓度高良姜素+MCP-1组MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表达出现升高现象,而Caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)。见图4,表5。

图4 western blot检测A549细胞中MCP-1、CCR2、Caspase-3蛋白表达;A ctrl组;B 低浓度高良姜素组;C 高浓度高良姜素组;D 吉非替尼组;E 高浓度高良姜素+MCP-1组

表5 5组A549细胞中MCP-1、CCR2、Caspase-3、Ki67、MMP-2蛋白表达比较 n=5,

3 讨论

肺癌属于发病率和死亡率都很高的疾病之一,而且由于科技的发展,人们的生活环境、方式等发生了重大改变,也会影响肺癌的发生,且发生趋势呈上升状态[14-15]。而且肿瘤的发生与肿瘤微环境也密不可分,其中大量的作用因子也会影响肿瘤的发展[16]。因此本文针对肺癌细胞中的趋化因子,检测高良姜素对于癌细胞的影响。

高良姜素主要是从高良姜中提取得到的,具有抗炎、抗氧化和抗过敏、抗肿瘤等良好的药理作用。相关文献报道,高良姜素对呼吸相关疾病有较好的作用[17]。而肺癌就类属于呼吸系统的疾病,所以本研究选取高良姜素探究其对人肺癌细胞的影响。结果显示,低、高浓度高良姜素以及吉非替尼处理均可降低人肺癌细胞的凋亡率,增殖水平,细胞创伤愈合率,以及细胞侵袭性,且高良姜素浓度越高,对应指标的变化趋势越明显。而高浓度高良姜素处理的人肺癌细胞对上述指标的影响与吉非替尼处理后相比较的差异无统计学意义,表明高良姜素可促进人肺癌细胞凋亡,增殖、迁移和侵袭。

已经有团队报道了有关MCP-1、CCR2信号通路的抗肿瘤作用,即在母细胞瘤中,CCR2的已知配体MCP-1,在肿瘤中高表达并募集CCR2从而促进肿瘤发展[18]。MCP-1/CCR2对于肾脏免疫细胞浸润也有作用,抑制MCP-1/CCR2就可以缓解慢性肾脏病;MCP-1还可以促进人类乳腺癌的发展,以及小鼠乳腺肿瘤的发展即MCP-1与肿瘤发生发展密切相关[19-20]。而研究MCP-1/CCR2信号通路与肺癌相关性的研究较少,基于MCP-1/CCR2信号通路的已有作用,本文进行了相关探究。结果显示与相关研究作用结果相似,人肺癌A549细胞MCP-1、CCR2蛋白表达升高,Caspase-3蛋白表达降低;低、高浓度高良姜素、吉非替尼处理均可降低人肺癌A549细胞中MCP-1、CCR2蛋白表达,升高Caspase-3蛋白表达。且高良姜素浓度越高,对MCP-1、CCR2、Caspase-3蛋白表达的作用越明显,推测高良姜素可能通过抑制MCP-1/CCR2信号通路促进对人肺癌细胞的凋亡等生物学行为影响。为了验证该猜想,本研究利用增加趋化因子MCP-1来干预高浓度高良姜素处理的人肺癌细胞,结果显示,MCP-1减弱了高浓度高良姜素对人肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用,并抑制了细胞凋亡。证实了高良姜素可能通过抑制MCP-1/CCR2通路抑制人肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。

综上所述,高良姜素可能通过抑制MCP-1/CCR2通路抑制人肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为,促进细胞凋亡。该研究为开发新的通过抑制MCP-1/CCR2信号通路治疗肺癌的药物提供了理论基础。然而,本研究尚存在不足之处,即高良姜素在体内对于抑制MCP-1/CCR2信号通路的影响效果尚且不知,而且可能高良姜素对肺癌还有不同的作用机制,有待后续实验的进一步深入探究。