茯苓酸调节CCL2-CCR2信号轴对急性心肌梗死大鼠心肌损伤的影响

赖震宇 赵展庆 符妹垂

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于冠状动脉快速闭塞,导致血氧供应不足,从而引起心肌梗死,具有高发病率[1]。梗死愈合是一个复杂的过程,由于愈合受损将导致梗死扩张,加速左心室重塑,愈合质量将严重影响恢复结局[2],因此寻找AMI后有效的治疗方法或者药物至关重要。AMI后过度的炎症反应导致心肌进一步损伤,因此早期及时抗炎治疗对AMI患者至关重要,而中药在此发挥显著优势,比如人参皂苷[3],莫诺苷[4]均被证明可通过抑制炎症反应保护心肌细胞,减轻心肌坏死。茯苓酸是中药茯苓提取物,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用[5]。研究发现茯苓酸可通过抑制大鼠miR-24减轻阿霉素诱导的心力衰竭[6],说明茯苓酸对心肌具有保护作用,而关于茯苓酸对AMI的作用尚无报道。在梗死的心肌中,心肌细胞坏死引发强烈的炎症反应,这不仅对心脏修复至关重要,而且会导致心脏的不良重塑和心力衰竭[7]。CC趋化因子在梗死的心脏中被显著诱导,单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1/CCL2)-CC趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2,CCR2)介导大量单核细胞的募集,导致过度炎性反应[8]。有研究表明敲低CCR2可减少招募单核细胞到梗死部位,从而缓解梗死炎症,促进心肌梗死愈合[9-10]。因此,本文探究茯苓酸对AMI大鼠心肌损伤的影响,及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 75只180～200 g雄性SD大鼠购自肇庆市瑞思元生物科技公司[SCXK(粤)2020-0053],本研究经医院动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 茯苓酸购自BioCrick;IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒购自酶联生物;苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒购自碧云天公司;CCL2、CCR2、Caspase-3、GAPDH抗体、HRP标记兔二抗购自CST公司。

1.3 左前降支结扎法构建AMI模型 首先戊巴比妥钠将大鼠进行麻醉,然后于左胸第4、5肋骨间隙开胸,充分暴露心脏,结扎冠状动脉左前降支,心电图显示ST段持续抬高则建模成功,并设置假手术组,只穿线,不结扎。

1.4 给药与分组 将大鼠分为假手术组、模型组,低、中、高剂量茯苓酸组,每组15只。造模后低、中、高剂量茯苓酸组分别腹腔注射10、20、30 mg/kg茯苓酸[11];假手术组、模型组注射等量的0.9%氯化钠溶液,连续14 d。

1.5 小动物超声仪检测心功能相关指标 末次给药结束12 h后,戊巴比妥钠麻醉大鼠,用小动物超声仪检测心功能相关指标,左心室射血指标(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)。

1.6 样品制备 大鼠进行心功能相关指标检测后,尾静脉取血,离心后获得血清用于ELISA法检测血清中炎症因子水平;处死大鼠,取心脏组织,5只大鼠心脏组织多聚甲醛固定用于HE染色;5只大鼠心脏组织多聚甲醛固定用于TUNEL染色;5只大鼠心脏组织暂存于-70℃,用于western blot实验。

1.7 ELISA法检测大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平 使用IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒检测大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平。

1.8 HE染色检测心肌组织病理损伤 将多聚甲醛中固定的心脏组织,石蜡包埋制备病理切片,HE染色,光镜下观察大鼠心肌组织病理损伤。

1.9 TUNEL染色观察心肌细胞凋亡 将多聚甲醛中固定的心脏组织,石蜡包埋制备病理切片,按照说明书进行TUNEL染色,计算TUNEL阳性率。

1.10 Western blot检测心肌组织CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表达水平 将大鼠心脏组织,剪碎成小块,加入裂解液RIPA,匀浆充分裂解,离心获得上清即蛋白,将蛋白用BCA法进行定量,随后进行western blot检测,步骤为电泳,转膜,脱脂乳封闭,孵育一抗(CCL2、CCR2、Caspase-3、GAPDH),孵育二抗,ECL显色,凝胶成像系统拍照,分析蛋白灰度值(Image J软件)。

2 结果

2.1 5组大鼠心功能相关指标比较 超声心电图结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠心功能相关指标LVEDD、LVESD均显著升高,LVEF、LVFS显著降低(P<0.05);与模型组相比,低、中、高剂量茯苓酸组大鼠心功能相关指标LVEDD、LVESD均显著性降低,LVEF、LVFS显著升高,且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠心功能相关指标比较 n=15,

2.2 5组大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比较 与假手术组相比,模型组大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,低、中、高剂量茯苓酸组大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠血清炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平比较 n=15,ng/mL,

2.3 5组大鼠心肌组织病理损伤 HE染色结果表明,假手术组大鼠心肌组织结构完整,细胞有序排列;与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织结构被严重破坏,有大量炎性细胞浸润;与模型组相比,低、中、高剂量茯苓酸组大鼠心肌组织结构逐渐恢复,炎性细胞浸润减轻,且呈剂量依赖性。见图1。

图1 5组大鼠心肌组织形态(HE染色×200)

2.4 5组大鼠心肌细胞凋亡率比较 与假手术组相比,模型组大鼠心肌细胞TUNEL阳性率显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,低剂量茯苓酸组、中剂量茯苓酸组、高剂量茯苓酸组大鼠心肌细胞TUNEL阳性率显著降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表3,图2。

图2 大鼠心肌细胞凋亡(TUNEL染色×400)

表3 5组大鼠心肌细胞凋亡率比较 n=5,%,

2.5 5组大鼠心肌组织CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表达水平 与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05),与模型组相比,低、中、高剂量茯苓酸组大鼠心肌组织CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表达水平显著降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表4,图3。

图3 Western blot检测5组大鼠心肌组织CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表达;A 假手术组;B 模型组;C 低剂量茯苓酸组;D 中剂量茯苓酸组;E为高剂量茯苓酸组

表4 5组大鼠心肌组织CCL2、CCR2、Caspase-3蛋白表达水平比较 n=5,

3 讨论

尽管心肌梗死患者的护理取得了重大进展,但心肌梗死后心力衰竭的发展仍然是心血管医学中最大的问题之一[12],比如心肌梗死后过度炎性反应会加速左心室重塑,因此炎症通路可能是预防心肌梗死后心肌损伤的重要靶点[13]。本文构建AMI大鼠模型,寻找可以抑制心肌梗死后炎性反应的药物,从而减少AMI后心肌损伤。

近年来中药在AMI治疗中取得显著进展,茯苓酸是中药茯苓的特有成分,也是茯苓的主要活性成分之一,具有多种与药效有关的药理活性,目前茯苓酸已经引起广泛关注,研究表明其具有抗炎,抗氧化及抗凋亡作用[14],因此本文想探究茯苓酸是否可发挥其抗炎以及抗凋亡作用减轻AMI引起的心肌损伤。

本文检测不同组大鼠心功能指标,发现AMI大鼠LVEDD、LVESD升高,LVEF、LVFS降低,表明当发生AMI时,心脏收缩和舒张能力显著性降低,经茯苓酸处理的AMI大鼠LVEDD、LVESD降低,LVEF、LVFS升高,表明茯苓酸有助于心脏收缩和舒张能力的恢复。接下来,检测心肌组织病理变化,结果显示AMI大鼠心肌组织结构被严重破坏,且有大量炎性细胞浸润,表明AMI引起严重的炎性反应,经茯苓酸处理的AMI大鼠心肌组织结构逐渐恢复,炎性细胞浸润减轻,表明茯苓酸可减轻AMI大鼠心肌损伤。

本文检测血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平,结果显示AMI大鼠血清中炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著性升高,茯苓酸干预的AMI大鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著性降低,表明茯苓酸抑制AMI大鼠炎性反应。细胞凋亡是细胞的程序性死亡,当机体受到应激时,启动一系列防御机制发挥保护作用,加速细胞的凋亡,在AMI中心肌细胞凋亡是其主要机制[15]。本研究发现,经茯苓酸处理的AMI大鼠心肌细胞凋亡率显著下降,表明茯苓酸可抑制心肌细胞凋亡。凋亡受多种蛋白调控,其中正常情况下caspase-3以酶原形式存在,应激时caspase-3被激活,从而启动细胞凋亡[16]。本研究显示,模型组大鼠心肌组织caspase-3蛋白表达量显著升高,当茯苓酸处理AMI大鼠时心肌组织caspase-3蛋白表达量显著降低,上述表明茯苓酸可通过抑制凋亡和炎性反应减轻AMI引起的心肌损伤。

趋化因子是由细胞因子组成的小的,高度保守的分泌蛋白家族,负责调节细胞运动[17]。其中有研究表明CC趋化因子的上调是心肌梗死后炎症和修复反应的标志,及时有效地抑制趋化因子信号传导可能保护梗死心脏免受不良重塑[18]。CCL2是CC趋化因子亚家族第一个被发现且充分研究的趋化因子,据报道CCL2可以与多种受体相结合,但其主要受体为CCR2,两者结合后可在多种心血管疾病中发挥作用,包括动脉粥样硬化[19],心力衰竭[20]等,因此猜测茯苓酸是否通过调节CCL2-CCR2信号轴发挥其减轻AMI大鼠心肌损伤的作用。本文检测心肌组织CCL2、CCR2蛋白表达水平,结果显示AMI大鼠CCL2、CCR2蛋白表达水平显著上调,而当茯苓酸干预AMI大鼠时CCL2、CCR2蛋白表达水平显著下调,表明茯苓酸可能通过抑制CCL2-CCR2信号轴改善AMI大鼠的心肌损伤。

综上所述,茯苓酸可能通过CCL2-CCR2信号轴改善AMI大鼠的心肌损伤,但是否存在其他通路调控此过程,需进一步研究。