沉默miR-572经铁死亡在肾癌细胞凋亡、索拉非尼耐药中的作用机制

潘亮 畅雅学 段万里 邓骞

肾癌是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤性疾病,占成人恶性肿瘤的2%～3%,此病患者主要症状包括血尿、腰痛和腹部包块等,对患者日常生活造成一定影响[1-2]。miRNAs是近年来肿瘤研究的热点之一,是一种长度21～25个核苷酸的内源性非编码基因,在人类基因组中可以序列特殊性方式调节30%～60%蛋白质编码基因表达,在肿瘤的发生、发展中起着关键作用[3]。铁死亡的出现与疾病的发生、发展及严重程度具有紧密的联系,在多种疾病的进展中均会起到一定的调控作用。研究表明,铁死亡能够作为困扰全球健康的肾癌抑制靶点,为其治疗方式及患者预后的改善情况开辟新的研究方向[4]。索拉非尼是治疗肾癌的有效药物治疗,但因过度用于临床且服药周期较长,一些患者在使用过程中出现耐药,导致疗效不显著,如何很好的改善索拉非尼耐药是一个亟需解决的问题[5]。本文主要探究miR-572经铁死亡在肾癌细胞凋亡、索拉非尼耐药中的作用,对改善肾癌患者治疗效果及预后具有重要意义,报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:人肾癌细胞系786-0购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.2 主要试剂:miR-572过表达质粒、miR-572 siRNA由广州威佳科技有限公司合成;DMEM培养基购于上海中乔新舟生物科技有限公司(货号:ZQ-100);p53抗体、SAT1抗体购于上海科敏生物科技有限公司(货号:bsm-33058M、bs-17244R)。(3)主要仪器:光学显微镜购于北京亿诚恒达科技有限公司(货号:Contour Elite);荧光定量PCR仪购于武汉益普生物科技有限公司(货号:CG-05)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:将肾癌细胞放置于含有10%胎牛血清、1%双抗(100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素)、1%谷氨酰肽的DMEM培养基中并放置于含5% CO237℃细胞培养箱温箱中,根据其生长情况2～3 d传代或换液1次,当细胞密度长至80%～90%时,使用胰蛋白酶消化传代进行后续实验。

1.2.2 细胞转染:取对数生长期的肾癌细胞,将其分为空白组(不做处理)、过表达组(肾癌细胞+miR-572过表达质粒)、沉默组(肾癌细胞+miR-572 siRNA)3组,每组2个复孔且分别加入100 μL 1×105个/mL细胞浓度的细胞悬液,当细胞培养至对数生长期时,在空白组、过表达组、沉默组分别加入常规细胞培养液做空白处理,miR-572 过表达质粒、Lipofectamine 2000试剂行过表达转染,miR-572 siRNA、Lipofectamine 2000试剂行沉默转染。

1.2.3 miR-572表达量:采用实时荧光定量PCR法检测miR-572表达量,实验步骤:肾癌细胞转染成功,Trizol法提取细胞中总RNA,应用mRNA逆转录试剂盒行逆转录获得cDNA,GAPDH为内参,提取细胞总RNA。miR-572引物序列:miR-572上游引物:5’-GTCCGCTCGGCGGTGGCCCA-3’,miR-572下游引物:5’-UGGGCCACCGCCGAGCGGAC-3’,设计引物反应条件:预变性95℃ 5 min:94℃ 20 s,56℃ 20 s;72℃ 1 min,40个循环,2-ΔΔCt计算miR-572表达量。

1.2.4 肾癌细胞凋亡:采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,取各组对数生长期肾癌细胞接种于6孔板培养48 h,收集肾癌细胞,PBS洗涤2次,调整细胞浓度为1×106/mL,70%冷乙醇固定,4℃过夜,PBS洗涤3次,再离心,去掉上清液及乙醇,并用Annexin V-FITC室温避光条件孵育15 min,用流式细胞仪进行荧光检测。

1.2.5 肾癌细胞索拉非尼耐药:以人肾癌细胞系786-0为诱导对象,索拉非尼为诱导药物,索拉非尼起始浓度为2.5 μmol/L,在25 cm2细胞培养瓶中,待786-0细胞生长密度达到80 %并且细胞状态良好时,换成1 %双抗、10 %胎牛血清,2.5 μmol/L索拉非尼的1640培养基,置于37℃、5% CO2孵箱内继续培养,开始耐药筛选。每天观察细胞的生长状态,待细胞生长至覆盖瓶底约90 %左右时按1∶2进行传代并冻存细胞以备使用。2.5 μmol/L索拉非尼作用细胞传代大约15代左右并且细胞能够在该浓度药物作用下稳定生长并传代后,增加药物浓度至5 μmol/L继续筛选。每次在同一药物浓度下作用细胞大约传代15代左右稳定后增加药物浓度,采用低浓度梯度法,分别以2.5、5、7.5、10 μmol/L的浓度梯度培养细胞,每个剂量设置3个复孔,培养72 h后,再加入CCK8试剂(10 μL/孔),培养1 h后,以空白组为对照,测定每组OD450值,以药物浓度为横轴,OD450值为纵轴,绘制浓度-效应曲线,确定半数抑制浓度(IC50),实验至少重复3次;用固定的索拉非尼浓度(4.91 μmol/L)处理每组细胞,CCK8法检测索拉非尼对肾癌细胞IC50值(IC502),采用IC501/IC502结果判定肾癌细胞索拉非尼耐药,其中值越大则说明能力越强。

1.2.6 p53-SAT1-ALOX15信号通路蛋白表达量:采用Western blot法检测p53-SAT1-ALOX15信号通路蛋白表达量,实验步骤:使用BCA试剂盒检测蛋白含量,120℃,10 min,电泳凝胶分离,将蛋白转运到PVDF膜上,温室封闭2 h,加一抗,4℃下室温孵育过夜,漂洗3次,15 min/次,加二抗,1 h室温孵育,反复漂洗3次,15 min/次,以β-actin为内参,计算蛋白表达量。实验均重复3次。

2 结果

2.1 3组miR-572表达量比较 沉默组miR-572表达量低于空白组,过表达组miR-572表达量高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05);沉默组miR-572表达量低于过表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组miR-572表达量比较

2.2 3组肾癌细胞凋亡比较 沉默组24 h、48 h肾癌细胞凋亡率高于空白组,过表达组24 h、48 h肾癌细胞凋亡率低于空白组,差异有统计学意义(P<0.05);沉默组24 h、48 h肾癌细胞凋亡率高于过表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2,图1。

图1 肾癌细胞流式细胞凋亡图

表2 3组肾癌细胞凋亡比较

2.3 3组肾癌细胞IC50相对值比较 沉默组IC50相对值低于空白组,过表达组IC50相对值高于空白组,差异均有统计学意义(P<0.05);沉默组IC50相对值低于过表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组肾癌细胞IC50相对值比较

2.4 3组p53-SAT1-ALOX15信号通路蛋白表达量比较 沉默组p53、SAT1、ALOX15蛋白表达量高于空白组,过表达组p53、SAT1、ALOX15蛋白表达量低于空白组,差异均有统计学意义(P<0.05);沉默组p53、SAT1、ALOX15蛋白表达量高于过表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4,图2。

图2 p53-SAT1-ALOX15信号通路蛋白WB图

表4 3组p53-SAT1-ALOX15信号通路蛋白表达量比较

3 讨论

据数据统计,肾癌多发于50～70岁人群,近年来,我国此病的发病率呈逐年上升的趋势,城市地区发病率高于农村地区,男性多于女性,男女患者比例约为2∶1[6-7]。目前临床上对于肾癌的病因尚未明确,认为此病的发生可能与遗传、吸烟、肥胖、高血压等因素密切相关[8]。众多研究显示,miRNAs对多种恶性肿瘤的生物学行为具有调控作用,进而在肿瘤发生、发展中起重要作用[9]。李玖玲等[10]研究显示,miR-299-3p在肾癌中可通过调控肾癌细胞EMT信号通路相关蛋白表达量,进而对肾癌细胞增殖、迁移、侵袭等产生影响。miR-572在近年来被证实与多种癌症发生、发展密切相关。研究表明,miR-572在肾癌中呈高表达,可能通过参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等,有望成为肾癌预后的一种标志物[11-12]。本研究表明,miR-572表达异常与肾癌细胞凋亡、索拉非尼耐药密切相关,有望成为肾癌早期诊断及术后检测的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点,对肾癌的诊断和治疗及预后具有重要意义。

临床研究显示,恶性肿瘤细胞可通过凋亡这种无害的方式被清除,进而对肿瘤的发生、发展起抑制作用[13-14]。本文采用miR-572过表达质粒、miR-572 siRNA对肾癌细胞分别过表达和沉默其表达,进而研究miR-572对肾癌细胞凋亡的影响,结果显示,沉默miR-572可有效促进肾癌细胞凋亡,为揭示肾癌发生、发展的分子机制提供了新的理论依据;但本研究并未涉及miR-572对肾癌细胞增殖、侵袭、迁移等方面的探究,存在一定局限性。索拉非尼一方面可通过作用多种信号通路,对肿瘤的发生、发展起关键调控作用;另一方面则通过阻断新生肿瘤血管形成,阻滞肿瘤发展[15]。鲍一等[16]认为,索拉非尼耐药是由基因改变引起的,研究表明CXCR4与索拉非尼耐药呈线性相关。本研究采用IC50相对值检测各组肾癌细胞索拉非尼耐药,结果表明沉默miR-572可有效降低IC50相对值,进而降低索拉非尼耐药,提高肾癌细胞靶向治疗的效果;但本研究并未对miR-572在索拉非尼耐药中的具体机制进行探究,存在一定局限性。

铁死亡是一种新的以铁依赖性的过氧化物集聚为特征的程序性细胞死亡方式,亦是区别于典型的凋亡和其他程序性死亡的新型系细胞死亡模式,目前已成为生物学研究和医学研究的热点[17]。p53-SAT1-ALOX15信号通路中p53是目前已知的重要抑癌基因,可介导细胞周期停滞、衰老、凋亡等,近年来研究表明,p53在细胞代谢、氧化反应和铁营养细胞死亡中具有新作用[18]。p53在肿瘤细胞铁死亡过程中发挥关键的调节作用,其在肿瘤细胞中表达升高,可减少胱氨酸摄取、GSH合成,抑制对谷胱甘肽过氧化物酶4活性,最终诱导细胞铁死亡[19]。有研究显示,SAT1是一种限速酶,由多胺分解代谢产生,其是p53的转录靶点,若其表达上调则可诱导脂质过氧化,细胞在活性氧诱导的应激下发生铁下垂,进而对细胞铁死亡产生调控作用[20-21]。铁死亡在疾病的发生、发展和治疗中的临床意义已逐渐显现,本研究表明,沉默miR-572可能通过上调p53、SAT1、ALOX15蛋白表达量,激活p53-SAT1-ALOX15信号通路诱导细胞铁死亡,阻滞肾癌发生、发展。

综上所述,本研究表明,沉默miR-572可能通过上调p53、SAT1、ALOX15蛋白表达量,激活p53-SAT1-ALOX15信号通路,进而激活铁死亡,促进肾癌细胞凋亡,抑制索拉非尼耐药,有望成为肾癌治疗潜在新靶点。