肝性脑病大鼠经粪便细菌移植后的肠道菌群宏基因组分析*

王威巍,刘丰睿,吕朝华,申呈祥

(1.重庆市铜梁区人民医院肝胆胰外科,重庆 402560;2.陆军军医大学第二附属医院肝胆外科,重庆 400037)

肝硬化是一种严重影响人类生活质量的疾病,会引起如肝性脑病(HE)等严重并发症。近年研究表明,微生物群和宿主之间的联系在HE的发病机制中起着关键作用,因此微生物群落组成和功能不仅可以应用在HE的诊断领域,其治疗作用还被探索用于HE的治疗[1-2]。

近年来,粪便细菌移植(FMT)已成为生物医学和临床医学的研究热点。FMT对不同疾病的临床反应为与各种疾病相关的微生物群-宿主相互作用提供了证据,如重症感染、糖尿病、癌症、肝硬化、肠道疾病和其他疾病[3-4]。

近年来,已有学者将FMT安全应用于代偿性肝硬化和酒精性肝硬化患者,并取得了有效的临床结果。对于HE患者,FMT不仅可以改变相关患者的认知功能,还可明显降低相关不良事件发生风险[5-6]。因此,本研究对HE大鼠进行FMT,通过研究其肠道微生物变化情况,以期进一步了解FMT后何种细菌发挥作用,为深入研究FMT相关机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选择雄性SPF级SD大鼠30只,体重(250.0±49.0)g,购于湖南安生美药物研究院有限公司,许可证号:SCXK(湘)2019-0004。各大鼠购回后适应性喂养1周,保持自由饮水、进食,通风,12 h明暗交替。将30只大鼠随机分为3组:A组为正常对照组,B组为HE模型组,C组为FMT组,每组10只。本研究通过重庆市铜梁区人民医院伦理委员会审核并批准(2021-40)。

1.2HE大鼠模型的建立 参照前期研究建立HE大鼠模型[7]。四氯化碳、大豆油按2︰3的比例混合,于B、C组大鼠颈背部皮肤皮下注射,首次注射按每100 g体重0.5 mL,而后按每100 g体重0.3 mL注射,每周注射2次;予5%乙醇自来水溶液自饮。A组正常喂养,普通饮水,颈背部皮下注射生理盐水。造模持续9周。

1.3模型验证 参照前期研究进行模型验证[7]。大鼠持续造模9周后,随机选取B组大鼠5只,A组大鼠1只,7%水合氯醛(每100 g体重0.5 mL)麻醉,暴露肝脏,可见B组大鼠肝脏相比A组大鼠病变明显,说明造模成功。

1.4各组大鼠的处理 B组进行同等剂量生理盐水灌胃;C组进行FMT,按200 μL/d(1 mL粪便细菌溶液中含粪便细菌1.5×1011)进行灌胃处理,移植细菌购于河北蓝域信科菌群资源中心。每天观察大鼠生存情况。收集大鼠肠道粪便进行宏基因组测序。

1.5肠道菌群宏基因组分析 参考朱宏斌等[8]的方法,进行细菌宏基因组分析。首先基于 Illumina NovaSeq/HiSeq高通量测序平台,采用全基因组鸟枪法策略, 将提取获得的菌群宏基因组总DNA,或宏转录组以mRNA为模板合成的cDNA双链,随机打断为短片段,并构建合适长度的插入片段文库,对这些文库进行双端测序。每个样本构建一个文库。对原始数据进行质量筛查,去除非目的序列(Trimmomatic 0.32,http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic),获取可用于下游宏基因组分析的高质量数据集。接着,在进行 BBCMS 校正后读取长序列,使用MEGAHIT进行拼接,构建宏基因组叠连群(contigs)序列集;使用软件MMseqs2的 linclust 模式将 contigs 序列集按相似度95%、对齐区域覆盖度90%(占短序列的比例)进行去冗余,获得非冗余的contigs集合,去冗余后采用专门用于预测原核微生物和宏基因组基因序列的 MetaGeneMark 软件(http://exon.gatech.edu/GeneMark/)识别其中的开放阅读框(ORF), 进行基因预测,获得非冗余氨基酸序列集。随后,对氨基酸序列使用KEGG数据库、GO数据库及EggNOG 数据库等进行功能注释,获得各等级的功能类群丰度谱,并进行功能组成分析、多样性分析、差异分析等。同时,对高质量数据集、非冗余氨基酸序列进行物种注释,获得种及种以下精细水平的物种组成谱,并进行物种组成分析、多样性分析、差异分析等。物种注释利用MEGAN比对NR数据库,利用R软件绘制门、纲、目、科、属、种分类等级的物种丰度柱状图。

1.6各组大鼠关键菌群的LEfSe分析 为了更加了解大鼠肠道菌种的显著差异,进行LEfse分析。通过 LEfSe 本地分析软件进行分析,并使用 R 软件的 ggtree 等包将分析结果可视化。

2 结 果

2.1大鼠一般生存情况和大便情况 实验过程共死亡大鼠9只,所有大鼠在建模后都出现不同程度嗜睡、反应迟缓及活动量变少情况,偶有厌食及消瘦。在FMT后2周,B组大鼠仍然持续上述变化,C组大鼠开始出现自主活动增加,进食增加并伴随大便明显好转呈正常状态。移植前,3组大鼠体重比较,差异无统计学意义(P>0.05);移植后,B组大鼠体重较A组明显下降,C组较B组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠移植前后体重变化

2.2各组大鼠肠道菌群结构差异分析 在门水平上,将注释到的菌门取20类进行绘制(图1)。与A组比较,B、C组中变形菌门的丰度升高,拟杆菌门的丰度下降;C、B组进行对比,拟杆菌门的丰度增加,变形菌门的丰度下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。在种水平上,将注释到的菌种取含量前20种的进行绘制(图2),与A组进行比较,B组中大肠杆菌(Escherichia coli)、拟杆菌(Bacteroides sartorii)、Dorea sp.CAG:317、志贺氏杆菌(Shigella sonnei)、梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)菌种的含量增加,而普雷沃氏菌(Prevotella sp.)MGM1、P2-180、P5-92及厚壁菌门细菌(Firmicutes bacterium)ASF500、0.1×D8-71、1×D42-67的丰度明显减少,C组相对B组改善明显。Dorea sp.CAG:317在C组丰度最高。韦恩图分析显示,3组大鼠共有相同菌种19 034种,A组与B组和A组与C组共有相同菌种分别为681、1 327种,B组与C组共有相同菌种1 148种;而有组别特异性的菌种为A组1 200种,B组865种,C组1 151种。

图1 门水平分布

图2 种水平分布

将每个样本的种水平分类单元按其丰度从高到低沿横坐标依次排列后,将丰度值经log2 对数转换作为纵坐标,在 R 软件中编写脚本绘制各样本的丰度等级曲线。丰度等级曲线显示,相对A组来说,B组菌种的丰度明显降低,FMT后,C组菌种的丰度明显增加(图3)。

图3 丰度等级曲线

2.3各组大鼠关键菌群的LEfSe分析 在种水平上,取3组大鼠肠道菌群LDA差异分析对数得分值大于4的菌种进行比较,结果显示,3组间具有显著差异的物种分别有拟普雷沃菌科、气单胞菌科及琥珀酸弧菌科等32种;肠杆菌科、梭状芽孢杆菌及志贺氏菌等48种;Dorea sp.CAG:317及乳酸杆菌属12种。不同种间LDA评分的柱状分布见图4,差异物种的系统发育分布见图5。

注:长度越长表明该分类单元的差异越显著。

图5 分类学分支图

3 讨 论

HE作为晚期肝硬化住院和发病的最主要原因,在实际治疗中,可以用于治疗的方案极其有限[9]。人类肠道和肝脏的微生物组通过影响每个系统的健康和疾病状态而共存,全身炎症及内毒素血症等影响肠道微生物的因素是HE发病的主要机制[10]。近年来,微生物-肠道-肝脏轴学说成为研究热点,肝脏通过门静脉系统及胆道系统与胃肠道直接相关,因此首先接触肠源性代谢物、细胞成分和激素等物质,与肝脏免疫细胞相互作用,引起炎症反应,诱发各种肝脏疾病的进展[11-12]。

肠道菌群是影响肠道功能的一个很重要的因素,关系到肝硬化及其并发症的进展[13]。FMT最近已成为肝硬化相关疾病的潜在治疗方法[14]。鉴于肠道微生物在HE的治疗中越来越被重视,现在很多的证据表明肠道微生物和HE的发病机制有关[5]。然而,就病程而言,肝硬化发生在HE之前,加之肝硬化是一个不可逆的过程,因此,研究关注点可能更应该在HE发生之前甚至是早期肝硬化。

众所周知,肝硬化也是原发性肝癌的一个前置性病变,所以对肝硬化的早期干预也无疑有益于肝癌的防治。越来越多的证据表明,从肝硬化前期到肝硬化、肝功能失代偿期直至肝移植,肠道菌群组成和功能的变化在肝脏疾病中起着重要作用[15]。本研究在动物的选择和FMT模型的构建方法上,作者团队在前期研究中也做了探索,最终选择死亡率更低、可重复性和观察性更好的SD大鼠作为最终的实验动物[7,16],在建模方法上最终选择了四氯化碳联合乙醇的方法构建HE模型[7]。

本研究结果发现,相对B组来说,C组在移植前后能有效改善大鼠的体重,使其体重增长情况更加趋近于A组,B组大鼠相对于A组表现出明显的下降趋势,后期也未得到改善。

既往宏基因组研究表明,肝硬化患者肠道菌群丰度存在降低现象,同时发生变化的是潜在致病菌,如肠杆菌科、葡萄球菌科和肠球菌科的相对丰度增加,潜在有益细菌毛螺菌科和瘤胃菌科的相对丰度降低[17]。本研究采用宏基因组手段分析了HE模型大鼠在FMT前后肠道菌群结构和功能的差异化,并对其做了物种 Alpha 多样性分析,丰度等级曲线结果表明,FMT可以显著改善HE大鼠肠道菌群的丰度。FMT后,肠道菌群的丰度基本上恢复到了与A组相当的水平。物种结果分析发现,3组分组菌群结构优势门是拟杆菌门和变性菌门,且相对A组而言,B组变性菌门丰度升高,而许多致病性细菌均属于这两门菌属,如大肠杆菌和痢疾杆菌、沙门氏菌属。而拟杆菌门丰度呈下降趋势,普雷沃菌属是拟杆菌门中优势属。相对于B组,C组变性菌门呈现下降趋势,拟杆菌门呈现升高趋势。这与前面的一些研究结论吻合[18]。上述研究结果提示,FMT可以有效地恢复肝硬化所带来的拟杆菌的损耗,同时也有效地抑制肝硬化所带来的变形菌的增加,因此推测FMT通过改变肠道菌群中不同菌的比例来调节肠道微环境进而达到有效治疗HE的目的。

本研究LEfSe分析结果表明,B组显著表达的菌种有大肠杆菌及梭状芽孢杆菌等,从构成上来说主要还是以变形菌门肠杆菌科为主,结果和前面的研究相吻合。而经过FMT后,乳酸杆菌及Dorea sp.CAG:317等益生菌占有更大优势,后者可能通过诱导Treg并抑制Th17细胞的分化和功能,从而调节肠道免疫反应,维持肠道黏膜屏障的完整性和稳定性[19],进而减少肠道有害物质进入门静脉系统损害肝脏。综上所述,FMT主要是通过改变肠道菌群中拟杆菌门和变形杆菌门中不同细菌的比例来调节肠道微生物环境,进而影响HE的病程和大脑的功能。作者团队既往的研究结果表明,FMT可以明显改善HE大鼠的肠道屏障功能及认知功能,进而改变大鼠的行为。因此有理由认为,FMT是针对肝硬化所致HE的一个潜在治疗方案[7],可改善患者的生活质量。

本研究不足之处在于,仅针对肠道细菌改变进行了研究,但对于肝硬化所致HE,大脑组织到底发生了何种改变仍值得研究。随后将进一步利用功能磁共振研究HE大鼠经FMT后大脑结构及功能,探索其作用机制。