基于网络药理学和分子对接探讨八珍汤治疗乳腺癌的作用机制*

党文军,聂 宏,刘 爽,孔祥颖,姜雨微△

(1.黑龙江中医药大学,黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)

乳腺癌是乳腺组织来源的癌症,占全球所有恶性肿瘤的7%～10%。根据2020年全球癌症负担数据表明,乳腺癌成为女性新发病例数1/4和死亡病例数1/6的常见恶性肿瘤[1]。在中医学理论中并无癌症的相关概念,现代医学认为肿瘤相关疾病属于中医学概念中的“癓瘕积聚”。《灵枢》中记载“积之始生,得寒乃生,厥乃成积。”中医学上的“乳岩”“乳核”等病名与乳腺癌属于同一疾病范畴。

八珍汤来源于《瑞竹堂经验方》,为气血双补功效的代表方剂,适用于气血皆虚证,为治疗正虚毒盛型乳腺癌的推荐方剂。而且八珍汤的中药组方均为国家卫生健康委员会公布的可用于保健食品的中药或药食同源中药材,且方便易做,在诸多的保健药膳方中均被推荐。有研究表明,八珍汤可以有效抑制乳腺癌细胞增长[2],促进乳腺癌患者创口愈合,改善术后焦虑、抑郁、癌性疲乏等情况[3-4]。查询文献,未能发现从细胞及分子水平解释八珍汤治疗乳腺癌的作用机制。在网络药理学的研究中,同一疾病的不同阶段是由不同的基因调控,同种基因可以调控不同疾病,这与中医的“同病异治”“异病同治”理论相一致。本研究拟通过网络药理学方法和分子对接技术,针对八珍汤的主要活性成分进行筛选、乳腺癌的相关靶点进行预测,探索药物与机体的相互作用关系,揭示潜在的作用机制,为八珍汤的临床应用及深入研究提供科学依据。

1 资料与方法

1.1八珍汤的活性成分及靶点 八珍汤方剂有药材八味,即白芍、白术、川芎、当归、茯苓、甘草、人参、熟地黄。利用TCMSP检索八珍汤的药材主要成分及靶点。考虑中药中并非所有成分都可以被人体吸收,参考现有文献及平台推荐,在检索结果中设置限定条件,以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为筛选阈值,得到化学成分信息作为候选活性成分。通过蛋白质数据库Uniprot将筛选候选靶点转化为基因名称,并删除不符合研究要求的靶点。

1.2乳腺癌相关疾病靶点的收集 以“breast cancer”或“breast carcinoma”为关键词检索与乳腺癌相关的靶标基因。通过在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、GenCards数据库、DisGeNET数据库收集疾病相关靶点。

1.3网络模型的构建与分析 使用Cytoscape3.7.2构建“中药-活性成分-靶点”网络。将药物与疾病取得交集的基因从药物的数据中选取对应的数据,将数据导入Cytoscape软件,得到“药物-有效成分-靶点”网络图。

1.4蛋白相互作用(PPI)网络构建与分析 将共同靶点数据输入STRING数据库获取靶标PPI网络关系,以minimum required interaction score>0.4为进行筛选标准,网络图中靶蛋白以节点呈现。利用Cytoscape3.7.2软件构建PPI网络。

1.5GO与KEGG富集分析 对药物靶点基因进行GO和KEGG富集分析,以P<0.05为筛选标准,筛选出显著富集的生物学注释,并将结果绘制成气泡图进行可视化分析。

1.6关键靶点与活性成分的分子对接 从TCMSP数据库中下载有效成分的结构式,并通过AutoDockTools软件转化格式后作为配体。从PDB数据库下载蛋白受体,再通过PyMOL软件删除水分子和小分子配体,通过Vina软件进行分子对接,利用PyMOL软件对结果进行可视化分析。

2 结 果

2.1八珍汤活性成分及作用靶点 在TCMSP数据库中检索筛选八珍汤主要组成药物的有效成分及靶点,共获得相关有效成分1 034个,靶点7 661个,去除重复成分后,根据阈值OB≥30%和DL≥0.18,筛选出有效成分2 336个,选取OB≥70%的活性成分列入表1。活性成分相应靶点的名称通过Uniprot数据库转换为基因名称,剔除重复及非人类靶点后,共获得211个潜在靶点。

表1 八珍汤活性成分

2.2八珍汤治疗乳腺癌的潜在靶点 查询GeneCards数据库,设置数据标准为relevance score≥15,得到与乳腺癌相关的靶点1 229个。检索OMIM数据库得到相关靶点168个。检索DisGeNET数据库,设置数据标准为score gda≥0.3,得到相关靶点30个。将3个数据库数据合并并删除重复项,最终得到靶点1 268个。与“2.1项”中靶点取交集后,最终获得乳腺癌相关靶点1 166个,八珍汤相关靶点109个,八珍汤治疗乳腺癌的潜在靶点共102个。

2.3构建“药物-有效成分-靶点”网络图 “药物-有效成分-靶点”网络图由230个节点和1 208条边组成,每个活性成分平均与5.25个靶点相互作用,度值大于5的活性成分有71个,其中槲皮素(quercetin)与76个靶点关联,山柰酚(kaempferol)与30个靶点关联,柚皮素(naringenin)与16个靶点关联,杨梅酮(myricanone)与13个靶点关联,β-谷甾醇(kaempferol)与12个靶点关联,人参皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)与8个靶点关联,豆甾醇(stigmasterol)与7个靶点关联,(+)-儿茶素[(+)-catechin]与5个靶点关联,马卡因(inermin)与5个靶点关联,灌木远志酮A(frutinone A)与5个靶点关联,原阿片碱(fumarine)与5个靶点关联。见图1。

注:绿色菱形代表的是乳腺癌潜在靶点,紫色椭圆形周围是八珍汤主要成分的化合物分子。边表示各节点之间相互作用关系,边的数量与化合物和靶点之间的作用关系成正比。

2.4PPI网络图 将八珍汤作用靶点与乳腺癌作用靶点的交集基因(102个)数据导入STRING数据库获取靶标PPI网络关系,此网络包含102个节点,2 047条边,见图2。度值前30的关键靶点为TP53、AKT1、ESR1、JUN、MYC、CASP3、EGFR、HIF1A、CCND1、STAT3、TNF、HSP90AA1、IL-6、MAPK3、PTGS2、FOS、IL-1β、ERBB2、MMP9、PPARG、CASP8,度值分别为92、86、83、83、80、79、77、77、75、74、74、73、73、69、68、67、67、66、66、64、60。

注:图形颜色越亮、图形越大代表度值越高,说明其对应的节点在网络中越重要。

2.5GO富集分析 对八珍汤的组方活性成分-潜在靶点网络中的102个靶点进行GO富集分析,共有2 233条GO数据条目(P<0.05)。生物学过程(BP)条目数最多,共有2 083条,根据通路上富集到靶点数目而分析,主要集中于对类固醇激素的反应(response to steroid hormone)、对氧化应激的反应(response to oxidative stress)、对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)、细菌分子过程的反应(response to molecule of bacterial process)。细胞成分(CC)相关条目有40条,主要由细胞膜筏(membrane raft)、细胞膜微区(membrane microdomain)、膜区域(membrane region)。分子功能(MF)相关条目有110条,主要有泛素样蛋白连接酶结合(ubiqutin protein ligase binding)、DNA结合转录激活因子的活性/RNA聚合酶Ⅱ特异性(DNA-binding transcription activator activity/RNA polymerase Ⅱ-specific)、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)。将每一类按照显著性进行排序,排在前10的富集条目的柱状图和气泡图展示,见图3。

图3 GO富集分析

2.6KEGG富集分析 对八珍汤的组方活性成分-潜在靶点网络中的102个靶点进行KEGG富集分析,共得到174条代谢通路(P<0.05)。进行KEGG富集分析,按照显著性进行排序,排在前20的富集条目的气泡图见图4。八珍汤治疗乳腺癌主要涉及脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、乙型肝炎(hepatitis B)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等。显示共同靶点主要集中于肝癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌等,主要信号通路涉及IL-17、TNF信号通路等。

图4 KEGG富集分析

2.7分子对接结果 筛选出主要3个度值较大的活性成分槲皮素、柚皮素、山柰酚,其与ATK1、CASP3关键靶点相互结合。其结合能均小于-5 kcal/mol(1 kcal=4.184 kJ),提示有效活性成分与关键靶点的结合活性较好,筛选的结果可靠。见表2。八珍汤抗乳腺癌的关键性成分与关键靶点的分子对接模式见图5。

表2 核心活性成分与关键靶点的分子对接

3 讨 论

乳腺癌成因复杂,除了癌症细胞本身的病变之外,还与炎性因素、血管微环境、成纤维细胞等肿瘤微环境相关[5],其产物与乳腺癌上皮细胞联系紧密。国内有研究表明,乳腺癌患者中气血亏虚证型居多,八珍汤是补气生血的代表方剂,主要治疗气血俱损时诸病。乳腺癌因为虚劳,脾肾亏虚,气血生化无源[6]。现阶段对于乳腺癌的治疗方法多有诸多不良反应,相比之下中医药的多靶点、多途径抑制肿瘤生长的优势逐渐体现[7]。

3.1八珍汤活性成分分析 本研究结果显示,八珍汤有效成分2 336个、潜在靶点211个与乳腺癌相关,初步筛选出11种核心成分,槲皮素、山柰酚、柚皮素、杨梅酮、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2、豆甾醇、(+)-儿茶素、马卡因、灌木远志酮A、原阿片碱。槲皮素为甘草的主要成分,对乳腺癌细胞具有细胞增殖、凋亡诱导、细胞周期阻滞、转移减少、氧化应激发展、雌激素受体调节及耐药降低功能[8],可以通过调节VEGF、PI3K/AKT/mTOR信号通路。而且伴随着槲皮素浓度升高,其抗肿瘤的作用增强[9]。有研究表明,槲皮素可以阻滞宫颈癌Hela细胞周期于G2/M期,下调Bcl/Bax诱导细胞凋亡。山柰酚为白芍、人参、甘草的主要成分,有研究表明,山柰酚诱导三阴性乳腺癌(TNBC)细胞中乳腺癌耐药蛋白的表达并下调抗肿瘤药物对细胞的杀伤力[10]。柚皮素为甘草的主要成分,其可以减少癌细胞的增殖,通过细胞周期阻滞在G2/M期,下调了MDA-MB-231细胞的生长[11]。此外,其还参与了调节线粒体介导的细胞凋亡信号转导,并在动物模型中显示了对二甲基苯蒽诱导的乳腺癌的抗炎潜力[12]。β-谷甾醇为白芍、人参、当归的主要成分,动物实验表明其可以上调miR-10a表达水平,诱导细胞凋亡和抑制细胞转移[13]。人参皂苷Rh2为人参的主要成分,可能通过mTOR、MAPK、TNF、泛素-蛋白酶体信号通路,对乳腺癌SKBR3细胞的活性进行抑制[14-15]。豆甾醇为熟地黄、人参、当归的主要成分,可以抑制人乳腺癌细胞MCF-7的增殖。

3.2关键靶点分析 本研究结果显示,八珍汤各活性成分作用于多个靶点,通过PPI网络分析,经过筛选后关键靶点为TP53、AKT1、ESR1、JUN、MYC、CASP3、EGFR、HIF1A等。TP53是位于17号染色体上的基因,编码为P53转录因子蛋白[16-17],在应激反应中,TP53会直接介导细胞凋亡的PUMA、NOXA、PERP和BAX等基因。TP53是乳腺癌中最常见的突变基因之一,TP53在约80%的TNBC中发生突变。AKT1靶点可以通过PI3K被胞外激活,激活AKT1可促进乳腺癌的增殖,抑制AKT1会促进肿瘤的迁移。雌激素受体(ER)是乳腺癌内分泌治疗的重要靶点之一,其中ESR1为编码ERα,约5%的原发肿瘤中存在ESR1突变,并且在转移性环境中显著富集(30%～40%)。ESR1突变转移表型中可以促进癌症的标志通路上调,包括雌激素反应、TP53通路、MTORC1信号[18]。ESR1突变细胞通过Notch信号通路富集了干细胞特性,该通路可能靶向于ESR1突变表达的肿瘤患者[19]。MYC是一种雌激素应答基因,MYC过度表达与ER+乳腺癌细胞和肿瘤模型中的激素独立性有关。雌激素介导的MYC基因表达的诱导是通过内质网和AP-1转录因子激活的上游增强子。MYC癌蛋白是许多细胞信号传导和代谢途径的主调节因子,通过允许癌细胞在特定药物诱导的应激下重新编程,与乳腺癌的耐药性有关。CASP3是细胞凋亡的核心蛋白、Caspase-3是Caspase-9的下游效应体;Caspase-3可能与其他底物相互作用,并可能通过HER2信号通路调节细胞凋亡[20]。EGFR是一种受体络氨酸激酶,参与血管生成、细胞增殖、转移和抑制细胞的凋亡。转录因子HIF1A是缺氧信号传导的典型主调控因子,在缺氧条件下易位到细胞核,并调节多种途径,包括血管生成和糖酵解。有研究表明,在小鼠和人类中,HIF1A本身的核表达在乳腺癌脑转移中增加,HIF1A信号通路可能在脑内乳腺癌细胞的增殖中发挥重要作用[21]。与原发性肿瘤相比,乳腺癌脑转移面临更深刻、更广泛的缺氧,这可能导致它们对HIF1A信号增殖的依赖增加。

3.3活性成分与关键靶点作用的分析 本研究KEGG富集分析结果显示,八珍汤治疗乳腺癌涉及多个BP,主要集中在脂质与动脉粥样硬化、流体剪切力与动脉粥样硬化、PI3K-AKT信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。GO富集结果显示,通路靶点包括对类固醇激素的反应、对氧化应激的反应、对脂多糖的反应等。在PI3K-AKT通路中,TP53可以激活Bax并且促进其表达上调,进而引起下游CASP级联反应,而AKT激活的磷酸化可以抑制BAD表达,导致Bcl-2和Bcl-xL减少,这2种调节途径均可以导致细胞凋亡[22]。EGF与EGFR结合,可以导致EGFR二聚化,促使酪氨酸激酶催化结构域的磷酸化,磷酸化酪氨酸残基也可激活PI3K-AKT通路[23]。类固醇激素是影响乳腺生长的重要激素,其中的ERα在乳腺癌中表达广泛。ERα可以将DNA甲基转移酶的表达上调,干预基因组DNA的甲基化。脂多糖可以促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长和侵袭[24]。IL-17信号通路与癌症发展历程也密切相关,相关研究表明,IL-17可以通过免疫细胞,产生促炎性细胞因子,间接性促进肿瘤生长[25]。IL-17的阳性表达为TNBC患者术后的独立影响因素,与预后不良紧密相关[26]。

山柰酚可以通过破坏细胞周期来抑制细胞生长,也能抑制MCF-7乳腺癌细胞对乳酸的吸收,导致癌细胞死亡。山柰酚能有效诱导MCF-7细胞中PARP的表达,导致下调Bcl-2蛋白表达。有研究发现,乳腺癌细胞的上皮-间充质转化会抵抗化疗,从而使化疗的效率降低,甚至导致化疗失败。LEE等[27]的研究结果表明,山柰酚能有效抑制内源性雌激素引起的乳腺癌转移,山柰酚的外源性异源化合物可有效抑制E2或三氯生诱导的上皮间质转化和转移蛋白的表达。同时山柰酚也可作为一种较强的NRF2诱导剂,调节NRF-7细胞中NRF2及其NQO1酶的表达,从而抑制癌基因的转化[27]。值得一提的是,山柰酚与其他果皮多酚,如杨梅素、槲皮素、红素、儿茶素、表儿茶素、花青素或白藜芦醇联合使用,显示出良好的抗癌活性。槲皮素能够调节肿瘤相关的氧化应激反应、细胞周期停滞及肿瘤增殖、凋亡、转移,其抗癌特性主要是通过调节VEGF、PI3K-AKT/mTOR、MAPK/ERK1/2和Wnt/β-catenin信号通路实现的。通过增加RIPK1和RIPK3的表达来诱导细胞坏死。文献报道与本研究结果一致,分子对接结果也验证了活性成分(山柰酚、槲皮素、柚皮素)与关键靶点具有较强的结合活性。表明八珍汤可以通过山柰酚、槲皮素、柚皮素等活性成分作用于AKT1、CASP3等相关靶点。

本研究针对八珍汤治疗乳腺癌的作用机制进行了分析,但是研究存在一定的局限性,如KEGG富集分析结果显示与乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路具有相关性等,缺乏研究支撑,仍需要日后进一步深入研究。本研究探讨了八珍汤治疗乳腺癌的可能作用机制,并筛选出关键靶点及信号通路,为以后八珍汤、乳腺癌的分子生物学验证研究提供了前期基础。