基于数据挖掘探究溪黄草药用成分及潜在抗癌的作用机制*

李小敏,张佳涵,梁宏轩,黄镇江,张振霞,郑玉忠,陈良辉,刘亚群

(韩山师范学院生命科学与食品工程学院,广东 潮州 521041)

溪黄草(Herba lsodi Lophanthoidis)为唇形科植物线纹香茶菜的干燥全草。线纹香茶草2个变种:风血草(狭基香茶菜)和纤花香茶菜,同属植物溪黄草,在一些地区也作溪黄草使用[1]。溪黄草具有很高的药用价值,常被用于治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎、癃闭、跌打瘀痛等病症。现代药理学研究中溪黄草具有抗炎、抗肿瘤、抑菌、增强免疫力的作用,且具有较强的抗氧化能力。通过对溪黄草化学成分分析发现,溪黄草还具备预防癌症发生的作用。其中溪黄草甲素是目前发现的对人类宫颈癌Hela细胞增殖具有极其明显抑制作用的成分[2]。对溪黄草化学成分进一步研究发现,其除对人宫颈癌细胞有着明显抑制作用外,还对消化癌、膀胱癌、消化道疾病等具有明显抑制作用[3]。

本研究利用多个大数据分析平台对溪黄草的有效成分进行筛选分析,结合相关数据库的疾病信息,得出溪黄草作用于癌症的靶点及机制,构建“药物-靶标-疾病”网络,为后续溪黄草辅助治疗癌症的作用机制提供理论参考。

1 资料与方法

1.1溪黄草成分的筛选 通过中国知网(http://www.cnki.net/)检索关键词“溪黄草”,并结合BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)和CancerHSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/CancerHSP.php)收集整理溪黄草化学成分,成分名称键入化源网(https://www.chemsrc.com/casindex/)查询CAS号,运用TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com)以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为条件,检索活性化学成分;在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索各成分的CAS号,下载其2D 结构并保存为SDF格式。上传至SwissADME在线平台(http://www.swissadme.ch/)进行再次筛选,设定条件:胃肠道吸收为“high”,5种DL(lipinski、ghose、veber、egan、muegg)预测结果有2个及以上为“yes”,生物利用度预测值≥0.50。

1.2有效成分作用靶点的收集与整理 采用SwissTargetPrediction在线平台(http://www.swisstargetprediction.ch/),限定物种为“homo sapiens”,进行靶点预测。删除可能性为“0”的靶点,去重后得到溪黄草有效成分的作用靶点。

1.3靶标基因的GO和KEGG富集分析 运用Metascape数据库(http://metascape.org/),限定物种为“homo sapiens”,对溪黄草治疗疾病的潜在靶点进行GO与KEGG富集分析,用以说明相关靶点在基因功能和信号通路中的作用。GO富集分析主要包括生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组成(CC)。通过在线作图平台微生信(http://bioinformatics.com.cn/)对富集分析结果进行可视化处理。

1.4蛋白质相互作用(PPI)网络构建 采用STRING平台(https://cn.string-db.org/,Version 11.5),限定物种为“homo sapiens”,最低相互作用评分设置为最高置信度(highest confidence=0.900),隐藏离散靶点,其余参数保持默认设置,得到溪黄草潜在作用靶点的PPI网络图。以node degrees最高的16个靶点基因为核心靶点。

1.5“药物-靶标-疾病”网络构建 运用NIMNT数据库(http://www.idrug.net.cn/NIMNT/)对度值大于0的靶标基因进行分析,预测该药可能的适应证。预测结果根据q<0.001进行筛选,并按从小到大排序。取前30个疾病与对应的核心靶点通过Cytoscape3.9.1构建“药物-核心靶标-疾病”网络,进一步利用CytoHubba插件、Network Analyzer插件分析网络,设置节点大小与颜色反映度值大小,使其相互作用结果可视化。

2 结 果

2.1溪黄草的化学成分 通过大量文献[4-22]的查阅与各中药成分数据库平台检索构建溪黄草的化学成分库。通过化源网对成分名称进行检索,初步获得化学成分270个,主要包括萜类共52个,挥发油类35个,酚酸类33个,甾醇类30个,醛类23个,酯类22个,酮类21个。

2.2活性药用成分筛选 通过TCMSP平台以OB≥30%,DL≥0.18为条件进行筛选。通过SwissADME平台进行毒药动力学分析,以肠胃吸收度为“high”及DL类别中有2个以上的“yes”为筛选条件,最终获得符合药用条件的活性成分共10个,分别为5,6,3′,4′-四羟基-7-甲氧基黄酮、铁锈醇、山柰酚、杜鹃黄素、槲皮素、槲皮素-3,3′-二甲醚、蓟黄素、木犀草素、松属素、异鼠李素,见表1。

表1 溪黄草的有效活性药用成分

2.3溪黄草靶标GO和KEGG富集分析 通过SwissTargetPrediction数据库进行靶点预测,结果去重后共得到靶点基因212个。使用Metascape数据库对靶点基因进行KEGG和GO富集分析,GO富集分析共得到BP 5 310条,CC 524条,MF 981条。结果显示,这些蛋白在BP中参与了蛋白质磷酸化、激素反应、细胞对有机环化合物反应、激酶活性调节、输运调节、GPCR发信号等过程。在CC上与转移酶复合物/转移含磷基因、树突、膜筏、胞质核周区、中心体、受体复合物等有关。在MF上主要与蛋白激酶活性、碳酸盐脱水酶活性、核受体活性、激酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性、氧化还原酶活性等相关(图1)。上述溪黄草活性成分的GO基因注释功能均与抗癌相关,如BP的蛋白质磷酸化几乎参与了细胞所有的生命过程,若其磷酸化位点发生突变时,可能导致恶性肿瘤的发生和发展[23]。

图1 溪黄草靶点GO和KEGG富集气泡图

KEGG通路富集分析共得到260条信号通路,推测溪黄草可能参与癌症的通路、氮代谢、神经活性配体-受体相互作用、磷脂酶D信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟、化学致癌-活性氧物种等相关信号通路(图1),上述通路与癌症、阿尔茨海默病存在联系,癌症通路中STAT3起核心作用,主要通过蛋白质磷酸化作用,与激酶结合,抑制树突状细胞的成熟[24]。氮代谢通路的衰减与癌细胞增殖有关,其中氨基酸和核苷酸中的氮会促进癌细胞生长[25-26]。而神经活性配体-受体相互作用通路可能与肺腺癌有联系。磷脂酶D信号通路中质膜上磷脂酶D活性的降低,从而影响免疫细胞的囊泡运输[27]。孕酮介导的卵母细胞成熟通路是由黄酮类物质介导的卵母细胞成熟,与卵巢癌密切相关[28]。

2.4溪黄草靶标PPI网络构建 将212个溪黄草的靶点基因导入STRING数据库,去除游离节点,最小互相体用阈值选择为“highest confidence=0.900”,其余为默认值,得到PPI网络图(图2)。去除度值为0的节点后得到148个靶点。其中度值较高的16个核心靶点为SRC、PIK3R1、PIK3CA、AKT1、ESR1、CDK1、EGFR、CCNB2、CCNB1、VEGFA、AR、CDK5、FYN、AKR1C3、CDC25A、CDK2。见图2。

图2 溪黄草活性成分交集靶点PPI网络图

上述核心靶标基因中,PIK3R1基因参与抑癌作用,使肿瘤患者获得PIK3R1基因的表达产物,可望通过调节PI3K信号转导通路的作用而显著减弱乳腺肿瘤细胞的侵袭能力。此外,PIK3R1多态性还与子宫内膜癌和膀胱癌的生存有关[29-30]。SRC可在外部信号转导入细胞时瞬间激活并使下游信号转导分子被磷酸化,通过信号传导最终影响细胞的黏附和侵袭能力。在乳腺癌、肺癌等肿瘤组织中,SRC处于异常活化状态[31]。PIK3CA基因已被证实为卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤的癌基因[32]。AKT1基因在调节肿瘤血管生成和癌症转移方面起关键作用[33]。ESR1基因中内含子多态性与乳腺癌风险增加有关,其表达失调可能参与细胞癌的发生和发展过程[34-35]。CDK1、CCNB1和CCNB2是潜在的预后生物标志物,与肝细胞癌(HCC)中免疫细胞的浸润有关,是HCC的潜在治疗靶点[36]。AR在三阴性乳腺癌(TNBC)癌变中起作用,可能是通过EGFR和PI3K-AKT信号通路完成的[37]。VEGFA几乎在所有的恶性肿瘤中起重要作用,且不仅在肿瘤血管生成中起重要作用,还能参与肿瘤免疫反应[38]。CDK5参与肿瘤生物学行为,包括致癌作用及抑癌作用,其高表达和信号传导的超激活已在乳腺癌、卵巢癌等多种癌症中有报道。CDK5作为癌基因促进细胞增殖、迁移和侵袭[39-41]。FYN在前列腺癌中的调节特别上调和在多种癌症中起促进作用[42]。AKR1C3表达的上调或下调发生在激素依赖性和激素非依赖性肿瘤中,其在PI3K-AKT、MAPK、ERK、IGF-1/AKT和PTEN/AKT等信号通路中发挥作用[43]。CDC25A的过度表达在肿瘤中表现出原癌基因的特性,逐渐成为抗癌药物中具有价值的分子靶标[44]。CDK2则与肝癌的发生和发展密切相关[45]。综上所述,以上靶点均与癌症有关,提示这些靶点可能是溪黄草治疗癌症的核心靶点。

2.5溪黄草适应证预测及“溪黄草-靶点-疾病”网络构建 将2.4得到的148个靶点导入NIMNT数据库,进行适应证分析,根据q<0.001对结果进行筛选并按由小到大排序,得到306个可能适应证,排在前30位的可能适应证见图3,主要包括乳腺癌、女性生殖器官癌、细胞型良性肿瘤、男性生殖器官癌、前列腺癌等。将前30个适应证和对应的核心靶点导入Cytoscape3.9.1软件构建“溪黄草-核心靶点-疾病”网络图,见图4。根据度值调整节点的大小和颜色,度值越大节点显示越大,颜色越深。结果显示溪黄草可能的核心靶标为VEGFA、EGFR、AKT1等,主要与男性生殖器官癌症、前列腺癌及肾癌等泌尿及男性生殖系统癌症有关。

图3 溪黄草适应证预测

图4 “溪黄草-核心靶点-疾病”网络图

3 讨 论

溪黄草为我国民间常见饮用草药茶,传统中医药理论指出其味苦性寒,具有清热、利湿、退黄等功效。现代药理学研究中提出溪黄草具有预防癌症发生的作用,但其作用机制和物质不详,限制了其在临床中的应用。为了进一步明确溪黄草的功效,本研究利用网络药理学能为中药预测提供科学技术和理论的作用,同时也探讨了溪黄草对癌症的干预和治疗的作用机制,为临床合理使用本药物治疗癌症提供了一定程度的科学理论依据。据相关研究表明,ESR1可能是表观遗传学方法诊断或治疗卵巢癌的潜在靶点及评估卵巢癌预后的潜在标志物[46]。CDK1是miR-143-3p和miR-495-3p的共同靶基因,CDK1在宫颈癌组织和细胞中出现过表达,而miR-495-3p和miR-143-3p的表达则出现下调。CDK1沉默会抑制宫颈癌细胞的活力,促进细胞凋亡[47]。PI3K的Ⅰ类成分,如催化部分PIK3CA和调节部分PIK3R1等与宫颈癌的肿瘤发生有关。PIK3CA在宫颈癌中表达为35%,在宫颈癌鳞状细胞癌中表达为38%,在宫颈腺癌中表达为39%[48]。PIK3CA和PIK3R1的突变与子宫内膜癌发生有关,93%的子宫内膜样肿瘤有突变,并表明有使用PI3K/AKT通路抑制剂进行靶向治疗的可能性[49]。此外,PIK3R1突变还与转移性前列腺癌有直接关联,且PIK3R1是调节胰岛素介导葡萄糖摄取的PI3K途径主要的参与者,其促进了癌细胞的生长,因此PIK3R1的突变可能成为多种癌症类型的致癌驱动因素[50]。本研究分析提示,ESR1、CDK1、PIK3CA和PIK3R1等均为溪黄草化学成分作用的核心靶点,预示着溪黄草中的某些化学成分可能通过调节ESR1和CDK1的活性,分别干扰与之相关的信号通路,以此抑制卵巢癌及宫颈癌的发展。而PIK3CA基因编码PI3Kα亚单位的蛋白和PIK3R1基因编码PI3K调节亚单位的蛋白,其突变通常导致PI3K-AKT信号通路异常激活,促进肿瘤细胞的增殖和生存。即表明溪黄草有关成分可能通过调节PIK3CA和PIK3R1的表达水平来调节PI3K-AKT信号通路的活性,并以此抑制宫颈癌、子宫内膜癌及前列腺癌细胞的增殖和迁移。综上可推测溪黄草可能在泌尿及生殖系统肿瘤治疗方面具有一定的应用潜力,但由于中药有效成分及作用靶点的筛选可能存在误差,以及通过对溪黄草成分进行系统检索和分析,可以看到在众多成分中,其有效药用成分种类甚少,其成分种类相关性、生物可及性和生物利用度需要后期重点关注及研究。因此,本研究并不能阐述溪黄草治疗癌症的完整机制,仍需要进一步的实验验证与技术支持来展开深入的探究。

综上所述,通过网络药理的研究可以发现溪黄草主要有效成分有5,6,3′,4′-四羟基-7-甲氧基黄酮、铁锈醇、山柰酚和杜鹃黄素等。并且每个有效成分都作用于多个靶点,GO和KEGG富集分析结果提示溪黄草可能与治疗癌症有关。通过对溪黄草潜在作用靶点PPI网络分析及筛选,得到溪黄草核心靶点有SRC、PIK3R1、PIK3CA、AKT1、ESR1、CDK1和EGFR等。这些靶点在癌症的发生发展过程中起着重要重用。核心靶点度值较高,说明这些靶点与活性成分之间联系极为密切,靶点之间也存在相互作用关系。同一靶点还能影响不同的BP和信号通路,起到不同的作用,共同起到治疗癌症的作用,体现溪黄草治疗癌症多药物活性成分、多交集靶点、多治疗通路的作用机制。此外,进一步聚焦核心靶点,本研究初步预测溪黄草可能与抗泌尿及男性生殖系统肿瘤疾病更为紧密。