胆管癌和胰腺癌患者胆汁酸分析及其潜在临床意义

李 倩,宁 波,易 航,钟 立

(1.重庆市第六人民医院消化内科,重庆 400064;2.重庆医科大学附属第二医院消化内科,重庆 400010)

胆管癌(CCA)是胆道系统的恶性肿瘤,主要起源于胆管上皮细胞;胰腺癌(PCC)是起源于胰腺导管上皮细胞的恶性肿瘤[1],二者病程中常常因侵犯胆道系统造成梗阻性黄疸而被诊断,但多数发现时已是肿瘤晚期,往往失去了最佳的手术机会,因此病死率极高。在过去 30 年,包括手术切除的全部CCA患者5年生存率仅为5%,而PCC患者5年生存率甚至低于5%[2-4]。因此,尽早诊断CCA及PCC对人类的生命健康至关重要。由于位置隐匿,影像学常常难以发现早期病灶,虽然目前已将包括糖抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)在内的血清学指标作为诊断胆胰系统恶性肿瘤的生物学标志物,但患良性胆道疾病(BBD),如胆管炎、胰腺炎等疾病的部分患者也合并CEA和CA19-9升高,因此其缺乏一定特异性,难以将良性及恶性疾病区分开来[5-6]。近年来,越来越多研究证明,对肿瘤及正常组织的代谢物进行分析,发现存在一定差异,这可用来鉴别诊断恶性肿瘤。临床上常常利用经内镜逆行胰胆管造影(ERCP)术抽取一定量胆汁进行分析,有助于疾病的诊断及治疗。胆汁由肝细胞产生,分泌进入胆道系统中,而胆胰系统位置邻近,因此胆胰系统肿瘤细胞的代谢及吸收将导致胆汁酸构成存在差异,因此可能从胆汁酸中检测出特殊生物学标志物用以诊断肿瘤[7]。此前有研究表明,与BBD导致的胆管梗阻相比,CCA及PCC等导致的胆管梗阻患者胆汁具有不同的胆汁酸代谢谱[7-10]。然而,大部分研究仅仅分析了常见的15种胆汁酸,且不同研究获取胆汁样本的方法及胆汁酸检测分析方法均存在差异,因此不同研究结果也存在差异,不能选出有代表性的生物学标志物。本研究通过ERCP方法采集BBD、CCA和PCC患者的胆汁,并对胆汁中40种胆汁酸进行定性及定量分析,并寻找对CCA及PCC诊断有意义的胆汁酸。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年10月至2021年10月重庆医科大学附属第二医院消化内科收治的胆管结石患者34例,其中男8例,女26例;年龄20～87岁,平均(60.88±18.58)岁,经超声、腹部 CT和(或)磁共振检查诊断,并排除其他消化道疾病。另选取同期收治的CCA患者20例、PCC患者8例。CCA组中男16例,女4例;年龄52～87岁,平均(70.00±9.46)岁,经组织病理学诊断,并排除其他消化道肿瘤。PCC组中男6例,女2例;年龄62～86岁,平均(70.75±9.63)岁,经组织病理学检查诊断,并排除其他消化道肿瘤。纳入研究的患者均未合并其他肝脏疾病,且近期未使用影响胆汁酸代谢的药物。

1.2胆汁获取与分析方法 纳入研究的患者行ERCP术,成功插入胆总管后,在注射造影剂前从胆管中抽取3～5 mL胆汁,并冻存放置于-80 ℃冰箱中。利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS,美国AB Sciex公司,AB ExionLC,AB Sciex Qtrap 6500+)对胆汁中的胆汁酸进行定性及定量分析,首先对样本进行预处理,将-80 ℃下保存的样本取出,在室温下解冻,移取100 μL样本,加入400 μL蛋白沉淀剂[V(甲醇)∶V(乙腈)=2∶1,含同位素内标CA-d4],涡旋振荡1 min,接着在冰水浴中超声提取10 min,在-20 ℃下静置30 min,离心10 min(13 000 r/min,4 ℃),取400 μL上清液挥干。再用200 μL甲醇水[V(甲醇)∶V(水)=1∶1,含内标 Lyso PC17和GCA-C13]溶液复溶,涡旋30 s,超声2 min,最后将样本液离心10 min(13 000 r/min,4 ℃),用注射器吸取200 μL的上清液,使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后,稀释100倍,转移到棕色进样瓶,-80 ℃下保存,直到上机分析。使用Phenomenex Kinetex C18色谱柱(2.1 mm×100.0 mm,2.6 μm)对样本梯度洗脱,然后利用AB Sciex Qtrap 6500+质谱仪对样本进行定量分析,获得质谱分析数据,对所有的色谱峰进行峰面积积分,并对其中同一物质在不同样本中的色谱峰进行积分校正。胆汁酸标准品包括胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、去氧胆酸(DCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺猪胆酸(THCA)、23-脱甲胆酸(23-NorCA)、甘氨猪胆酸(GHCA)共16种胆汁酸。

2 结 果

2.13组血清指标比较 与BBD组相比,CCA组血清中胆汁酸、总胆红素(T-BILI)、碱性磷酸酶(ALP)和直接胆红素(D-BILI)的水平显著更高,而PCC组ALP、T-BILI、D-BILI和CEA水平显著高于BBD组,PCC组球蛋白(Glb)和CEA水平高于CCA组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组患者血清指标水平比较

2.23组胆汁酸谱比较 利用LC-MS/MS方法定量检测了3组患者胆汁中的40种胆汁酸,其中包括了16种可检测及24种无法检测出的胆汁酸亚型。

2.2.13组总胆汁酸、初级及次级胆汁酸、牛磺及甘氨结合胆汁酸、总结合及非结合胆汁酸比较 与BBD组比较,CCA组甘氨结合胆汁酸、总结合及非结合胆汁酸、次级胆汁酸和总胆汁酸水平明显更低,PCC组初级胆汁酸水平较BBD组更高,差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,与CCA组相比,PCC组初级胆汁酸、总结合及非结合胆汁酸、总胆汁酸水平更高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 3组总胆汁酸、初级及次级胆汁酸、总结合及非结合胆汁酸、牛磺及甘氨结合胆汁酸比较

2.2.23组16种胆汁酸亚型比较 CCA组CDCA、23-NorCA、GLCA、GDCA、GCDCA和TDCA水平显著低于BBD组,而PCC组TCA水平明显高于BBD组,PCC组CDCA、CA、GHCA、TCA、GCDCA、GCA和THCA水平明显高于CCA组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 3组可检测的16种胆汁酸水平比较

3 讨 论

近年来不少研究发现,组织器官长期暴露于高水平胆汁酸环境中发生肿瘤的风险更高,如肝恶性肿瘤、结直肠恶性肿瘤、CCA和PCC等的发生发展都与胆汁酸密切相关[11]。细胞与胆汁酸相互作用,肿瘤细胞的代谢导致了胆汁酸成分及含量的改变,胆汁酸促进了肿瘤的发生发展[12-14]。本研究对BBD、CCA和PCC患者胆总管中的胆汁酸成分进行了定性及定量分析,进一步对比分析,以寻找对肿瘤诊断有临床意义的生物学指标。

本研究结果发现,与BBD组及PCC组相比,CCA组总胆汁酸水平明显更低,分析可能与胆汁酸导致胆管细胞炎性损伤,进而引起胆汁酸分泌减少有关,此前已有研究证实这一点[10]。在人体中,法尼醇X受体(FXR)为胆汁酸的核受体,可被其激活,并作用于胆汁酸和脂质代谢过程,CCA发生时导致胆道梗阻,胆汁淤积使得FXR被胆汁酸激活,通过一系列信号通路作用于肝细胞,减少胆汁酸的合成,进而减轻胆汁淤积及胆管细胞的毒性损伤[15]。然而JUSAKUL等[9]研究表明,CCA组患者较BBD组有更高水平的总胆汁酸,这与本研究结果相反,推测原因是不同的胆汁酸获取方式导致结果存在差异,与胆囊穿刺获取胆汁不同,本研究利用ERCP插管抽取胆汁进行分析,而胆囊对胆汁酸有浓缩储存作用,因此会导致不同研究的分析结果有差异。此外,本研究结果表明,CCA组较BBD组的次级胆汁酸水平更低,初级胆汁酸通过胆道系统分泌进入肠道,通过肠道菌群的酶解作用产生次级胆汁酸,而CCA导致胆道梗阻,初级胆汁酸进入肠道受阻,因此次级胆汁酸生成障碍,进而水平降低,并且有研究发现,部分次级胆汁酸可减轻胆管细胞的炎性损伤,如UDCA可增加胆管细胞钙离子表达,激活钙离子依赖的蛋白激酶C-α(PKC-α)信号通路,进而抑制胆管细胞的增殖和分泌,因此次级胆汁酸水平降低将对胆管细胞的保护作用也降低[16]。本研究发现,CCA组患者较BBD组胆管中的甘氨结合胆汁酸、总结合及非结合胆汁酸水平更低,这与既往的研究结果不一致[7-9]。通过体外实验,发现结合胆汁酸可通过激活一系列细胞信号通路,上调人CCA细胞中环氧合酶2(COX-2)的表达,增加了前列腺素E2(PGE2)的合成,进而加剧胆管细胞的炎性损伤,并对CCA的发生发展起重要作用[17-18]。另有研究表明,结合胆汁酸可作用于核因子-κB(NF-κB),通过激活相关信号通路阻断胆管细胞凋亡,这增加了肿瘤的发生风险[10]。DAI等[19]在体外试验中利用结合胆汁酸作用于胆管细胞,发现这些细胞中FXR的mRNA和蛋白表达水平较未处理的胆管细胞更低,FXR对减少胆汁酸分泌的反向调节作用减弱,加剧胆汁淤积,增加了胆管细胞的炎性损伤,促进CCA的发生发展。这些研究说明CCA组应含有更高水平的结合胆汁酸,这与本研究的结论不相符,分析这可能与不同研究纳入不同地区人群有关。此外,本研究通过定性及定量分析各组之间的胆汁酸亚型,发现CCA组患者的CDCA和TDCA水平较BBD组明显更低。CDCA可通过激活FXR对NF-κB信号传导通路产生抑制作用,进而减轻胆汁酸对胆管细胞的炎性损伤[15]。另有研究发现,TDCA可通过钙PKC-α和丝裂原激活的PKC依赖信号通路抑制人CCA细胞的生长,不利于CCA的发生[20],这能解释CCA组的CDCA和TDCA水平显著更低。体外细胞研究表明,GDCA和GCDCA作用于胆管细胞,激活NF-κB信号通路、降低FXR的mRNA和蛋白表达,加重胆汁淤积,进而促进CCA细胞生长[19-21]。本研究数据却表明,CCA组患者胆管中GCDCA、GLCA和GDCA的水平较BBD组显著降低。此外,本研究还表明,与BBD组相比,CCA组23-NorCA水平更低,但导致这种差异的机制尚不清楚,推测这可能与23-NorCA具有更低的疏水性相关。

本研究通过对PCC组胆汁中胆汁酸进行分析,发现PCC组较BBD组有更高水平的初级胆汁酸和TCA。CA、CDCA均属于初级胆汁酸,与次级胆汁酸相比,初级胆汁酸的疏水性更高,胆汁淤积时细胞长时间暴露于高水平胆汁酸中,导致细胞炎性损伤,反复地炎性刺激将导致细胞癌变,增加肿瘤发生的可能。有研究表明,TCA可激活PKC-α细胞通路诱导顶端钠离子依赖性胆汁酸转运体表达,增加细胞对胆汁酸摄取,进一步加重胆汁淤积,导致胆汁反流进入胰管中,对胰腺导管上皮细胞产生炎性损伤,增加了细胞癌变风险[22]。而CCA组与PCC组之间的胆汁酸差异可能与细胞组织学差异有关,这需要更多研究探讨其中的原因。

总之,本研究对CCA、PCC和BBD患者胆管中总胆汁酸、初级及次级胆汁酸、结合及非结合胆汁酸、甘氨及牛磺结合胆汁酸和可检测出的16种胆汁酸亚型进行了定性及定量分析,并对比各组之间胆汁酸成分及水平差异。胆管梗阻导致胆汁淤积,影响胆汁酸的分泌及排泄,高水平胆汁酸长期作用于胆管细胞和胰腺导管上皮细胞,正常细胞在反复炎性刺激下发生恶变的风险极高。本研究发现,CCA组总胆汁酸、次级胆汁酸、CDCA、TDCA和23-NorCA水平显著低于BBD组,而PCC组初级胆汁酸和TCA水平较BBD组更高。因此,本研究发现恶性肿瘤组与BBD组胆汁酸的组成及水平存在明显差异,其中23-NorCA、TDCA、CDCA、次级胆汁酸、总胆汁酸可作为辅助诊断CCA的潜在生物学标志物,初级胆汁酸、TCA对PCC的辅助诊断有一定参考价值。但与既往研究结果存在一定差异,且本研究为单中心研究,纳入的样本量较小,因此有待进一步的研究分析探讨胆汁酸在CCA及PCC中的相关作用机制。