酱渣大豆异黄酮大孔树脂纯化工艺及其抗氧化活性研究

唐银 陈婧司 沈子绮 何贵萍 张佳琪 吕远平

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.03.010

引文格式：唐銀，陈婧司，沈子绮，等.酱渣大豆异黄酮大孔树脂纯化工艺及其抗氧化活性研究[J].中国调味品，2024，49（3）：61-67.

TANG Y， CHEN J S， SHEN Z Q， et al. Study on purification process of soybean isoflavones from sauce residue by macroporous resin and its antioxidant activity[J].China Condiment，2024，49（3）：61-67.

摘要：研究酱渣大豆异黄酮的纯化工艺及其抗氧化活性。选用5种树脂（AB-8、HPD300、ADS-7、DM301、D101）进行静态吸附试验，筛选吸附效果最好的树脂，再以动态吸附试验筛选最佳纯化工艺，最后研究纯化后酱渣大豆异黄酮的抗氧化活性。结果表明，AB-8树脂的吸附效果最好，在流速1.5 mL/min、pH 3的条件下吸附0.6 mg/mL的样品溶液75 mL，再用100 mL 60%乙醇溶液解吸，样品纯度可由11.37%提升到55.84%；纯化后的酱渣大豆异黄酮具有较好的抗氧化活性，其浓度为0.07 mg/mL时，对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率分别为93.35%和98.67%。AB-8树脂可用于酱渣大豆异黄酮的分离纯化且效果较好，酱渣大豆异黄酮具有较强的抗氧化活性。

关键词：酱渣；大豆异黄酮；大孔树脂；纯化；抗氧化

中图分类号：TS264.24      文献标志码：A      文章编号：1000-9973（2024）03-0061-07

Study on Purification Process of Soybean Isoflavones from Sauce Residue

by Macroporous Resin and Its Antioxidant Activity

TANG Yin1， CHEN Jing-si2， SHEN Zi-qi1， HE Gui-ping1，

ZHANG Jia-qi1， LYU Yuan-ping1*

（1.College of Biomass Science and Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065， China;

2.School of Public Health， Suzhou Medical College of Soochow University， Suzhou 215123， China）

Abstract： The purification process and antioxidant activity of soybean isoflavones from sauce residue are studied. Five resins （AB-8， HPD300， ADS-7， DM301 and D101） are selected for static adsorption test to screen the resin with the best adsorption effect， and then the optimal purification process is screened by dynamic adsorption test. Finally， the antioxidant activity of soybean isoflavones from sauce residue after purification is studied. The results show that AB-8 resin has the best adsorption effect. Under the conditions of the flow rate of 1.5 mL/min and pH 3， 75 mL 0.6 mg/mL sample solution is adsorbed， and then desorbed with 100 mL 60% ethanol solution. The purity of the sample can increase from 11.37% to 55.84%. The purified soybean isoflavones from sauce residue have good antioxidant activity. When its concentration is 0.07 mg/mL， the scavenging rates on DPPH radicals and ABTS radicals are 93.35% and 98.67% respectively. AB-8 resin can be used for the separation and purification of soybean isoflavones from sauce residue with good effect， and soybean isoflavones from sauce residue have strong antioxidant activity.

Key words： sauce residue; soybean isoflavones; macroporous resin; purification; antioxidant activity

收稿日期：2023-07-21

基金项目：2021年度四川大学-泸州市人民政府战略合作项目（2021CDLZ-18）

作者简介：唐银（1999—），男，硕士，研究方向：食品科学与营养健康。

*通信作者：吕远平（1971—），女，教授，博士，研究方向：食品科学。

酱渣是酱油酿造的副产物，每生产1 t酱油会产生0.67 t酱渣[1]。酱油由大豆酿造而成，因此酱渣中含有丰富的营养物质[2]。目前酱渣主要用于制备动物饲料和肥料，但由于其水分和盐含量太高，这些产品存在适口性差或易导致土壤盐化等问题[3-4]。酱渣中富含大豆异黄酮，因此，从酱渣中提取大豆异黄酮可能成为酱渣高值化利用的一个重要方向[5]。

大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次级代谢产物，影响人体激素分泌、蛋白质合成、生长因子活性等[6-7]。此外，大豆异黄酮在保护血液系统、保护神经系统、治疗糖尿病和增强免疫系统等方面都具有较好的作用，因此被广泛研究并应用于医疗和食品行业[8-9]。

大豆異黄酮的纯化方法主要有大孔吸附树脂纯化法、薄层层析法、硅胶色谱法、膜分离法等[10]。薄层层析法更多应用于黄酮类化合物的检测、鉴定等方面[11]。硅胶色谱法可能会用到三氯甲烷或醋酸乙酯等，不宜用于食品中相关物质的提取[12]。膜分离法是近年来迅速发展起来的一种高新技术，纯化效果较好，但该技术还不够成熟[13]。大孔树脂是一类具有较好吸附性能的有机高聚物吸附剂，选择性较好、使用方便且可重复利用，在黄酮类化合物的纯化方面应用较广泛[14]。本文用大孔吸附树脂法探究酱渣大豆异黄酮分离纯化的最佳工艺，为酱渣的综合利用及大豆异黄酮的纯化提供了理论参考。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

酱渣：由四川合江县永兴诚酿造有限责任公司提供；无水乙醇（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；2，2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；AB-8、HPD300、ADS-7、DM301、D101大孔树脂：江苏东鸿化工有限公司。

1.2  主要仪器与设备

UV-6000PC紫外可见分光光度计  上海元析仪器有限公司；H1850高速台式离心机  湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；RE-52A旋转蒸发器  上海亚荣生化仪器厂；KQ5200DE数控超声波清洗器  昆山市超声仪器有限公司；SQP电子天平  赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；数控计滴自动部分收集器  上海沪西分析仪器厂有限公司；PHS-3C型pH计  上海仪电科学仪器股份有限公司；SCIENTZ-10N冷冻干燥机  宁波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-C水浴恒温振荡器  上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

1.3  试验方法

1.3.1  大豆异黄酮的提取

取适量脱脂酱渣，以料液比1∶50加入55%乙醇溶液，于温度50 ℃、超声功率420 W条件下提取130 min。将提取液于6 000 r/min条件下离心20 min，上清液用旋转蒸发仪浓缩得大豆异黄酮粗提液，备用[15]。

1.3.2  大豆异黄酮纯度的测定

参考王林美等[16]的方法测定大豆异黄酮的纯度。将1.3.1所得大豆异黄酮粗提液和纯化后的大豆异黄酮溶液浓缩、冻干，得到干粉。取适量大豆异黄酮干粉，用95%乙醇溶液溶解并定容至100 mL，在259 nm波长处测定其吸光度。按公式（1）计算大豆异黄酮的纯度。

X=8.453 2×A－0.981 7M×10×100%。（1）

式中：X为大豆异黄酮的纯度，%；A为样品溶液的吸光度；M为样品的质量，mg。

1.3.3  大孔树脂预处理

取5种树脂AB-8、HPD300、ADS-7、DM301、D101，用95%乙醇溶液浸泡24 h，用蒸馏水洗涤至无醇味；再用5%的氢氧化钠溶液浸泡12 h，用蒸馏水洗涤至中性；最后用5%的HCl溶液浸泡12 h，用蒸馏水洗涤至中性，备用。

1.3.4  静态吸附-解吸试验

1.3.4.1  树脂的筛选

分别称取5种树脂各5 g于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL质量浓度为0.4 mg/mL的大豆异黄酮粗提液，于25 ℃下振荡吸附24 h。吸附结束后，用蒸馏水洗涤吸附后的树脂，加入60%乙醇溶液20 mL，于25 ℃下振荡解吸24 h，测定大豆异黄酮的浓度。按照公式（2）～（4）分别计算吸附率、解吸率和回收率。

Q=C0－C1C0×100%。（2）

D=C2C0－C1×100%。（3）

P=C2C0×100%。（4）

式中：Q为吸附率，%；D为解吸率，%；P为回收率，%；C0为吸附前大豆异黄酮的浓度，mg/mL；C1为吸附后大豆异黄酮的浓度，mg/mL；C2为解吸液中大豆异黄酮的浓度，mg/mL。

1.3.4.2  静态吸附动力学试验

称取5 g AB-8大孔树脂于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL质量浓度为0.6 mg/mL的大豆异黄酮粗提液，于25 ℃下振荡吸附，定时测定溶液中大豆异黄酮的浓度，直至吸附率趋于稳定，绘制静态吸附曲线。

1.3.5  动态吸附-解吸试验

1.3.5.1  泄漏曲线的绘制

取20 g预处理后的AB-8大孔树脂湿法装柱（1.6 cm×30 cm），径高比约为9.5∶1，以质量浓度为0.6 mg/mL、流速为1.5 mL/min、pH为3上样吸附，用自动收集器分段收集流出液，检测流出液中大豆异黄酮的质量浓度，绘制泄漏曲线。

1.3.5.2  上样液质量浓度

固定上样流速为1.5 mL/min，上样液pH为3，分别吸附质量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的大豆异黄酮提取液，用自动部分收集器收集流出液，测定流出液中大豆异黄酮的浓度。

1.3.5.3  上样流速

固定上样液质量浓度为0.6 mg/mL，上样液pH为3，分别以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/min的上样流速吸附，用自动部分收集器收集流出液，测定流出液中大豆异黄酮的浓度。

1.3.5.4  上样液pH

固定上样液质量浓度为0.6 mg/mL，上样流速为1.5 mL/min，分别吸附pH为1，2，3，4，5的大豆异黄酮提取液75 mL，计算吸附率和吸附量。

1.3.5.5  解吸液乙醇浓度

分别用30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，以1.5 mL/min的流速洗脱吸附后的树脂，分段收集流出液，计算解吸率。

1.3.5.6  解吸液体积

用60%的乙醇溶液，以1.5 mL/min的流速洗脱吸附后的树脂，分段收集流出液，计算不同体积乙醇溶液的解吸率，确定最佳解吸液体积。

1.3.6  大孔树脂纯化工艺验证

参照筛选得到的最佳纯化工艺，对酱渣大豆异黄酮进行纯化，将所得解吸液进行浓缩，冷冻干燥得到大豆异黄酮粉末，计算纯度。

1.3.7  酱渣大豆异黄酮抗氧化能力研究

1.3.7.1  酱渣大豆异黄酮对DPPH自由基清除率的测定

分别配制浓度为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07 mg/mL的酱渣大豆异黄酮溶液和VC溶液，作为待测样品。取2 mL样品溶液与2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合，室温下避光静置30 min，在517 nm处测定吸光度（A1）；取2 mL样品溶液与2 mL 无水乙醇混合，室温下避光静置30 min，在517 nm处测定吸光度（A2）；取2 mL无水乙醇与2 mL 0.1 mmol/L的 DPPH溶液混合，室温下避光静置30 min，在517 nm处测定吸光度（A3），按公式（5）计算样品对DPPH自由基的清除率[17]。

Q=1－A1－A2A3×100%。（5）

1.3.7.2  酱渣大豆异黄酮对ABTS自由基清除率的测定

分别配制浓度为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07 mg/mL的酱渣大豆异黄酮溶液和Vc溶液，作为待测样品。取0.2 mL样品溶液与4 mL ABTS工作液混合，静置10 min，在734 nm处测定吸光度（A1）；取0.2 mL蒸馏水与4 mL ABTS工作液混合，静置10 min，在734 nm處测定吸光度（A2），按公式（6）计算样品对ABTS自由基的清除率[17]。

Q=1－A1A2×100%。（6）

2  结果与讨论

2.1  静态吸附-解吸试验

2.1.1  树脂的筛选

大孔吸附树脂对样品的吸附效果受树脂极性、比表面积和孔径等的影响，在选择树脂时，应从多方面进行考虑，所选5种树脂的物理特性及其对酱渣大豆异黄酮的吸附性能比较分别见表1和图1。

由表1和图1可知，5种树脂对大豆异黄酮均具有一定的吸附能力，其中AB-8的吸附率最高，可能是因为AB-8具有较大的比表面积，且与大豆异黄酮都是弱极性，从而能更好地吸附大豆异黄酮[18]。此外，AB-8、DM301和HPD300的解吸性能都很好，AB-8的回收率最高，综合考虑，选择AB-8纯化大豆异黄酮。

2.1.2  吸附动力学曲线

吸附动力学反映了吸附剂对样品的吸附能力及其达到吸附平衡所需的时间。分别用准一级动力学模型和准二级动力学模型评价AB-8吸附酱渣大豆异黄酮的过程，得到的动力学曲线见图2，动力学模型拟合参数见表2。

由图2可知，随着吸附的进行，AB-8对酱渣大豆异黄酮的吸附率逐渐增大，且在前5 h增长较快，而在5 h后，吸附率增长较慢，并逐渐趋于稳定。由表2可知，准二级动力学模型的R2大于准一级动力学模型，且预测的吸附率可达到76.3%，较准一级动力学模型（69.3%）高，因此该吸附过程更加接近准二级动力学模型特性，表明吸附过程可能是单层吸附，受到边界层扩散和颗粒内扩散等的影响[19]，同时较长的吸附平衡时间也满足准二级动力学吸附的特征。

2.2  动态吸附-解吸试验

2.2.1  泄漏曲线绘制

泄漏点是评价树脂吸附能力的重要指标，在动态吸附中，当流出液中样品浓度达到上样液浓度的10%时视为达到泄漏点，若继续吸附，会导致样品大量损失。

AB-8吸附酱渣大豆异黄酮的泄漏曲线见图3。

由图3可知，随着吸附的进行，树脂的吸附点位逐渐减少，树脂的吸附能力逐渐减弱，流出液中大豆异黄酮的浓度逐渐增大。当流出液体积达到75 mL时，大豆异黄酮的浓度为0.604 mg/mL，达到泄漏点，此时吸附量为2.17 mg/g；当流出液体积继续增大，流出液中大豆异黄酮浓度增长较快，样品损失较多，当流出液体积达到210 mL时，大豆异黄酮浓度接近上样液，树脂吸附达到饱和，此时吸附量为3.46 mg/g。因此，确定最佳上样体积为75 mL，此时树脂吸附量达到饱和吸附的62.67%。

2.2.2  上样液质量浓度的确定

由图4和图5可知，随着吸附的进行，流出液中大豆异黄酮的浓度逐渐增大，上样液浓度越大，达到泄漏点越快。在样品浓度较小时，树脂的吸附点位较多，因此吸附量逐渐增大，当样品浓度为0.6 mg/mL时，吸附量达到最大值（2.17 mg/g），当样品浓度过大时，树脂在短时间内吸附达到饱和，且样品中杂质的浓度也较大，可能导致树脂被杂质覆盖或堵塞，泄漏点出现过早，进而导致吸附效果不佳[20]。因此，选择0.6 mg/mL为适宜的上样液质量浓度。

2.2.3  上样流速的确定

由图6和图7可知，上样流速影响吸附量的大小与泄漏点出现的早晚，随着流速的增大，吸附量逐渐减小，泄漏点出现逐渐提前。在流速为2.5 mL/min时，泄漏点在35 mL时就出现，此时吸附量仅为1.16 mg/g，这是由于流速过快导致异黄酮分子还未与树脂充分接触，样品吸收不充分[21]；在流速为0.5 mL/min时，酱渣大豆异黄酮的吸附量为2.48 mg/g，是所有流速中吸附量最大的，但其达到泄漏点所需的时间太长，不利于操作；在流速为1.5 mL/min时，酱渣大豆异黄酮的吸附量可达到2.18 mg/g，与流速为0.5 mL/min时的吸附量差距不大，但其达到泄漏点所需的时间远远小于流速为0.5 mL/min时，此时树脂吸附酱渣大豆异黄酮的效果较好且所需时间不长。综合考虑，适宜的上样流速为1.5 mL/min。

2.2.4  上样液pH的确定

由图8可知，吸附率和吸附量随pH增大的变化规律相同，都是先增大后减小，在pH为3时达到最大值，此时吸附率为90.57%，吸附量为2.17 mg/g；当pH增大或减小时，吸附率和吸附量都减小。异黄酮分子中含有酚羟基，在溶液中呈酸性，但在pH小于3的环境中，由于酸性太强，溶液中的氢离子与异黄酮分子竞争吸附点位，而在pH大于3的环境中，异黄酮分子的稳定性可能较pH为3时低，因此吸附率和吸附量都降低[22]。综上，选择pH为3的上样液较适宜。

2.2.5  解吸液乙醇浓度的确定

适当的乙醇浓度有利于减弱树脂对大豆异黄酮的吸附作用，从而达到解吸的目的。解吸液浓度对解吸率的影响见图9。

由图9可知，当乙醇浓度为60%时，解吸率最大（94.16%），其他浓度的乙醇溶液解吸率都较小。低浓度的乙醇溶液减弱树脂对大豆异黄酮吸附作用的能力较弱，因此不能将大豆异黄酮有效地洗脱下来；而根据相似相溶原理，高浓度的乙醇溶液并不能使大豆异黄酮有效溶出，反而会导致其他大分子杂质被洗脱，使得纯化效果减弱[23]。因此，适宜的解吸液乙醇浓度为60%。

2.2.6  解吸液体积的确定

解吸液体积与解吸率的关系见图10。

由图10可知，随着解吸液体积的增加，大豆异黄酮的解吸率逐渐增大。当解吸液体积为0～60 mL时，解吸率增长较快；当解吸液体积为60～80 mL时，解吸率增长较缓慢；当解吸液体积达到80 mL后，解吸率达到90%以上，增长极缓慢。综合考虑解吸所用时间以及解吸液消耗量，选择最佳解吸液体积为100 mL，此时解吸率为94.16%。

2.3  純化前后大豆异黄酮的纯度

采用AB-8树脂纯化酱渣中大豆异黄酮，以上样流速为1.5 mL/min、上样液浓度为0.6 mg/mL、pH为3上样吸附75 mL，吸附结束后用100 mL 60%乙醇溶液进行解吸，纯化后样品的纯度由11.37%提升到55.84%，与邵哲等[24]的研究结果相似，表明该工艺纯化酱渣大豆异黄酮效果较好。

2.4  酱渣大豆异黄酮的抗氧化活性研究

2.4.1  DPPH自由基清除率试验

由图11可知，随着样品浓度的增大，酱渣大豆异黄酮对DPPH自由基的清除率逐渐提升，在浓度达到0.06 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到90%以上。在0.01～0.05 mg/mL范围内，样品浓度与DPPH自由基的清除率具有线性关系，通过回归方程计算出酱渣大豆异黄酮清除DPPH自由基的IC50为0.023 mg/mL，VC的IC50为0.009 mg/mL，表明酱渣大豆异黄酮具有较强的DPPH自由基清除能力，但稍弱于VC。

2.4.2  ABTS自由基清除率试验

不同浓度酱渣大豆异黄酮和VC对ABTS自由基清除能力的比较见图12。

由图12可知，随着样品浓度的增大，酱渣大豆异黄酮和VC对ABTS自由基的清除率都逐渐提升且比较接近。通过回归方程计算出酱渣大豆异黄酮和VC清除ABTS自由基的IC50分别为0.024 mg/mL和0.018 mg/mL，两者比较相近，表明酱渣大豆异黄酮具有较强的ABTS自由基清除能力。

3  结论

本试验通过静态吸附和解吸试验，从5种大孔吸附树脂中选择AB-8树脂纯化酱渣中大豆异黄酮。通过动态吸附和解吸试验优化纯化条件，并对其抗氧化活性进行了初步研究。结果表明，AB-8树脂对酱渣大豆异黄酮具有较好的纯化效果，在上样液浓度为0.6 mg/mL、pH为3、上样流速为1.5 mL/min的条件下上样吸附75 mL，并用100 mL 60%乙醇溶液进行解吸，得到的大豆异黄酮纯度可达55.84%。此外，纯化后的酱渣大豆异黄酮具有较好的抗氧化活性，当其浓度为0.07 mg/mL时，对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率分别为93.35%和98.67%。综上所述，AB-8大孔树脂对酱渣大豆异黄酮的纯化效果好，具有较高的理论价值，能为酱油副产物的回收利用提供一定技术参考。

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