血清1-磷酸鞘氨醇联合透明质酸检测对结直肠癌的诊断及预后价值

陈丹丹，胡嘉捷，刘鷖雯，何怡青，杨翠霞，张国良，高 锋，杜 艳

（1.上海交通大学医学院附属第六人民医院中心实验室，上海 200233；2.上海交通大学医学院附属第六人民医院检验科，上海 200233）

近年来，我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病率和死亡率呈持续增长、年轻化趋势［1］。多数CRC 患者在被确诊时已经处于疾病的的中晚期，而现有的循环肿瘤标志物都存在各自的局限性，因此寻找早期筛查CRC 的新型无创性标志物尤为重要［1］。

1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-phosphate，S1P）是一种多效性鞘脂代谢物，能通过结合细胞表面1-磷酸鞘氨醇受体调节癌细胞的异常增殖及转移、血管和淋巴管新生以及肿瘤的化学耐药等，从而促进多种癌症的发生发展［2，3］。有研究报道S1P 在CRC患者血清中的水平显著高于肠道良性疾病患者和健康体检者［4］。透明质酸（hyaluronan，HA）是由双糖重复单位构成的细胞外基质的重要成分之一，其在多种肿瘤如转移性乳腺癌、结直肠癌中异常升高，并 与 患 者 的 预 后 不 良 相 关［5，6］。既 往 研 究 发 现HA 能够参与调控肿瘤细胞的迁移、侵袭以及肿瘤相关血管及淋巴管生成［6-8］。另有研究发现HA 可通过与淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1 结合从而调控S1P 受体表达［9］。基于S1P 受体受HA 调控的机理，我们推测S1P 和HA 可能在肿瘤进展中存在交互作用，且S1P 与HA 皆以可溶性分子形式存在于血液中。因此，两者联合检测可能在CRC 的早期筛查和手术疗效监测中发挥协同以及互补的作用，目前未见相关研究报道。本研究旨在探讨CRC 患者术前术后血清S1P 及HA 水平变化与CRC 的关系，以期为CRC 的辅助诊断和预后评估提供新的潜力标志物。

1? 资料与方法

1.1 研究对象

选取2022 年9～12 月期间本院47 例CRC 患者作为结直肠癌组，30 例肠道良性疾病患者作为良性疾病组，38 名健康体检者作为健康对照组。结直肠癌组男性31 例、女性16 例，年龄29～87 岁；良性疾病组（结肠炎、克罗恩病、腺瘤）：男性20 例、女性10例，年龄23～83 岁；健康对照组：男性26 名、女性10名，年龄50～72 岁，血糖、血脂、血压、肝功能和肾功能等指标均正常。3 组间年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经我院伦理委员会批准，且所有研究对象均知情同意。纳入标准：（1）病理确诊；（2）术前未经放疗、化疗等处理；（3）比较全面的临床资料。排除标准：（1）有恶性肿瘤病史；（2）术前进行过放化疗等治疗；（3）临床资料不完整；（4）依从性较差。

1.2 研究方法

搜集所有受试者的临床资料，包括年龄、性别、肿瘤大小、TNM 分期、淋巴转移状态、神经侵犯情况、脉管侵犯情况、血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、血清糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9， CA19-9）等。其中结直肠癌组有8 例肿瘤大小未知，4 例淋巴转移情况不详，5 例神经侵犯未知，5 例脉管侵犯情况不明，9 例Ras 基因型信息缺失。

清晨采集所有受试者空腹静脉血3 mL，离心分离血清，并分装冻存于-80 ℃冰箱。利用Epoch 酶标仪（美国BioTek 公司）和ELISA 试剂盒（上海酶联生物）检测S1P。采用全自动化学发光免疫分析仪MAGLUMI®X8（深圳新产业）及配套试剂检测HA。所有操作均按照厂商说明书进行。

1.3 统计学处理

采用SPSS 26.0 软件和Graphpad 8.0 软件对所有数据统计分析，非正态分布的计量资料以M（P25～P75）表示。两组之间的比较用两独立样本Wilcoxon 检验。术前术后指标比较用配对样本Wilcoxon 检验。S1P 和HA 指标的相关分析采用Spearman相关性分析。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析各指标诊断CRC的效能。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 健康对照组、良性疾病组和结直肠癌组之间血清S1P 和HA 水

血清S1P 的水平在健康对照组、良性疾病组及结直肠癌组中逐次升高（Z=-3.533，P＜0.001；Z=-2.371，P＜0.05）。结直肠癌组血清HA 水平显著高于健康对照组（Z=-2.393，P＜0.05），而良性疾病组分别与结直肠癌组和健康对照组之间的HA水平差异无统计学意义（Z=-2.371，P＞0.05；Z=-1.123，P＞0.05）。见表1。

表1 各组之间血清S1P 和HA 水平的比较［M（P25～P75）］Tab 1 Comparison of serum S1P and HA levels among the three groups ［M（P25～P75）］

2.2 结直肠癌患者血清S1P 和HA 水平与临床病理特征的关系

血清S1P 水平与结直肠癌组患者TNM 分期（早/晚期）和淋巴转移有关，晚期CRC 患者血清S1P 水平低于早期CRC 患者（P＜0.05）；淋巴转移阳性CRC 患者血清S1P 水平显著低于淋巴转移阴性CRC 患者（P＜0.05）。另外，本研究结果显示，血清HA 水平与结直肠癌组患者TNM 分期和脉管侵犯有关，晚期CRC 患者血清HA 水平低于早期CRC患者（P＜0.05）；脉管侵犯阳性的CRC 患者血清HA 水平低于脉管侵犯阴性的CRC 患者（P＜0.05）。见表2。

表2 结直肠癌患者血清S1P 和HA 水平与临床病理特征的关系Tab 2 Relationship between serum S1P and HA levels and clinicopathological features of patients with colorectal cancer

2.3 血清S1P 和HA 的相关性分析

Spearman 相关分析显示，术前结直肠癌患者血清S1P 与 HA 水平呈正相关，相关方程为：Y=4.449X+450.8（r=0.406，P＜0.05）。见图1。

图1 结直肠癌患者术前血清S1P 与HA 水平的相关性Fig 1 Correlation between preoperative serum S1P and HA levels in patients with colorectal cancer

2.4 血清S1P 和HA 辅助诊断结直肠癌的效能

S1P、HA、CEA 及CA19-9 4 项指标单独及联合诊断结直肠癌的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.871、0.642、0.694、0.593 及0.916，敏感性分别为88.60%、40.90%、56.80%、45.50% 及81.80%，特异性分别为76.50%、91.20%、79.40%、100.00%及88.20%。见表3 和图2。

图2 各项指标单独和联合辅助诊断结直肠癌的ROC 曲线Fig 2 The ROC curve for the diagnosis of colorectal cancer by individual and combined tests

表3 各项指标单独和联合诊断结直肠癌的ROC 曲线参数Tab 3 The ROC curve parameters for the diagnosis of colorectal cancer by individual and combined tests

2.5 血清S1P 和HA 辅助诊断CEA 和/或CA19-9阴性的结直肠癌的效能

S1P、HA、CEA 及CA19-9 单 独 及 联 合 诊 断CEA 和/或CA19-9 阴性的结直肠癌的AUC 分别为0.860、0.656、0.636、0.516 及0.897，敏 感 性 分 别 为86.50%、37.80%、62.20%、35.10%及78.40%，特异性 分 别 为76.50%、97.10%、67.60%、100.00% 及88.20%。见表4 和图3。

图3 各项指标单独和联合检测诊断CEA 和/或CA19-9 阴性的结直肠癌的ROC 曲线参数Fig 3 The ROC curve for the diagnosis of CEA and/or CA19-9 negative colorectal cancer by individual and combined tests

表4 各项指标单独和联合诊断CEA 和/或CA19-9 阴性的结直肠癌的ROC 曲线参数Tab 4 The ROC curve parameters for the diagnosis of CEA and/or CA19-9 negative colorectal cancer by individual and combined tests

2.6 结直肠癌患者各项指标术前、术后变化

结直肠癌患者术后血清HA、CEA 和CA19-9 水平均显著降低（Z=-3.381，P=0.001；Z=-5.103，P＜0.001；Z=-2.942，P=0.003）；血清S1P 水平术前、术后差异无统计学意义（Z=-1.014，P=0.310）。见图4。

图4 结直肠癌患者各项指标术前、术后变化Fig 4 Preoperative and postoperative changes of various indexes in patients with colorectal cancer

3 讨论

结直肠癌是世界第四大致命癌症，预计到2035年，全球CRC 新病患将持续增加至250 万［10］。目前CRC 筛查方案主要是危险度评估及粪便隐血试验，若结果为阳性，再行结肠镜检查［1］。然而粪便隐血试验和粪便DNA 标志物检测等非侵入性检查分别存在低敏感度、高成本或低效益等不足［11］。常用的血液肿瘤标志物如 CEA、CA19-9 也缺乏高度敏感性和脏器特异性［12］。虽然肠道镜检是“金标准”，但其属于有创检查方法，且费用高、患者依从性差，还存在出血、穿孔的风险［11］。综上所述，现有的结直肠癌早期筛查手段存在一定的局限性，迫切需要一种能高效筛查和预后判断的新型生物标志物或联合检测方法。

既往研究认为大多数结直肠癌是由分子和遗传改变引起［13］，近年来，研究发现结直肠癌代谢异常与结直肠癌发病率和死亡率呈年轻化趋势密切相关［14］。S1P 是种多效性脂质介质，由鞘脂代谢产物鞘氨醇在鞘氨醇激酶的磷酸化作用下形成［2］。生理条件下，健康人血浆中S1P 浓度在300～500 nmol/L，其主要来源于红细胞，并在免疫系统等方面起重要作用［15］。当肿瘤发生时，肿瘤细胞及其相关基质细胞以自分泌或旁分泌的方式释放S1P 至肿瘤微环境，介导癌细胞增殖、侵袭转移、血管及淋巴管生成等过程［2］。本研究显示CRC 患者血清S1P水平在健康对照组、良性疾病组、结直肠癌组呈现递增趋势（P＜0.001，P＜0.05），提示血清S1P 具有鉴别诊断CRC 的潜力。HA 也参与人体的新陈代谢，是细胞外基质的重要成分，其在结直肠癌肿瘤间质中呈高表达［16，17］。本研究结果显示，结直肠癌患者血清HA 水平显著高于健康体检者（P＜0.05），亦初步提示HA 具有辅助诊断结直肠癌的潜能。

另外，结直肠癌组早期患者血清S1P 和HA 水平均高于晚期患者，且Spearman 相关分析结果显示S1P 水平与HA 水平呈正相关，这提示两者联合检测在结直肠癌早期辅助诊断中可能发挥协同互补的优势。此外，血清S1P 水平在3 组之间具有显著性差异，而血清HA 在良性疾病组和结直肠癌组之间的差异不及S1P 变化显著（P＞0.05），这有可能与良性疾病组患者体内存在促HA 合成的炎症因子相关，故HA 需与其他标志物结合以提高诊断的特异性。本研究还发现，淋巴结转移阳性CRC 患者的血清S1P 水平显著降低（P＜0.05），该结果与前人在前列腺癌和结直肠癌中的结论一致［4，18］，Nunes 等［18］在研究前列腺癌时检测了受试者的红细胞状态，发现相对于健康对照组，前列腺癌患者红细胞S1P 合成酶的活性较低，且循环S1P 水平的降低与红细胞中S1P 合成酶1 活性下降趋势一致，这提示血清S1P水平下降与癌症的早期进展相关，并非与临床临床转移状态联系。然而仍然有必要对其分子机理进行进一步的探讨，并分析其临床应用价值。另外，类似的情况也出现在HA 的分析结果中，无脉管侵犯的CRC 患者HA 水平高于发生脉管侵犯的患者（P＜0.05），这可能是由于肿瘤微环境下细胞外基质发生重构，导致HA 发生降解。研究显示HA 的降解产物如低分子量HA 在结直肠癌组织中异常升高，与患者的预后不良相关［19］。然而由于低分子量HA 的检测需经离心、过滤、抽提等复杂过程，有待于未来方法成熟及简化后，再做比较研究。

通过ROC 曲线分析，发现血清中S1P、HA 联合传统指标CEA、CA19-9 检测诊断CRC 的效能值明显高于单一指标，值得关注的是，在针对CEA 和/或CA19-9 阴性的CRC 的ROC 曲线分析结果中，发现四项联合诊断能明显提高CRC 诊断敏感性，提示联合S1P、HA 联合传统标志物或可提高结直肠癌患者的检出率。

术后动态监测对于防止肿瘤复发起关键作用，因此我们对CRC 患者的术后血清S1P、HA 指标也进行了分析。既往研究表明CEA 与CA19-9 的半衰期分别为1～5 d、1～3 d［19］，故本次研究选择CRC 患者术后3～5 d 的血清样本进行检测。研究发现CRC者术后3～5 d 血清HA 水平显著降低（P＜0.001），与张等［8］研究结果一致，提示对CRC 患者术后的疗效监测具有重要意义。此外，CRC 患者血清S1P 水平在肿瘤切除手术前后差异没有显著统计学意义（P＞0.05），这可能是S1P 较长的半衰期所致。因此，相对于HA，CRC 患者术后血清S1P 水平降低可能相对延迟，这进一步提示S1P、HA 结合检测在CRC 患者术后疗效监测中具有互补性。由于本研究系单中心研究，且侧重纳入术前术后血清样本配对的CRC病例，致使样本量较小，后续将扩大规模，联合其他医学中心收集更多样本，并进行追踪研究。

综上，血清S1P 与HA 在CRC 辅助诊断及预后监测中展现出相关性和互补性，结合传统肿瘤标志物CEA、CA19-9，能够在结直肠癌诊断和疗效监测中发挥一定的临床价值。

作者贡献度说明：

陈丹丹参与文章构思与设计、数据收集与整理以及原稿写作；胡嘉捷参与样本收集、数据收集与管理、原稿审查与编辑；刘翳雯、何怡青进行样本检测、数据收集与管理；杨翠霞、张国良、高锋参与文章审查与编辑；杜艳负责文章构思与设计，文章质量控制与审查。

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