基于16S rDNA 测序对中重度牙周炎伴脑梗死患者龈下菌斑微生物群落结构分析

钟晓雪，王 慧，陈敏哲，常 睿，贺小宁，2

（1.海南医学院，海南 海口 570100；2.海南医学院第二附属医院口腔科，海南 海口 570100）

牙周病是由多种致病因素引起的感染性疾病，牙菌斑生物膜是最主要的致病因素，以慢性牙周炎最常见。越来越多的证据表明，牙菌斑中的致病微生物及其代谢产物引起的全身炎症和免疫反应是许多系统性疾病的潜在危险因素，包括心脑血管疾病、糖尿病、类风湿性关节炎和阿尔茨海默病等［1-4］。脑梗死是脑卒中的一种重要分型，由各种原因导致脑血管闭塞出现相应神经功能障碍的缺血性脑血管疾病，其病变基础是动脉粥样硬化。目前的证据表明，动脉粥样硬化斑块中具有复杂的微生物群，其微生物起源于口腔、肠道、呼吸道和皮肤［5］。多项研究通过多种检测方法在患者动脉粥样硬化斑块中发现牙周致病菌［6，7］，提示主要来自龈下菌斑的牙周致病菌可能在动脉粥样硬化斑块形成和发展中起着重要作用。16S rDNA 测序是一种敏感、快捷并且准确的细菌组学检测手段，可以较全面地评估宿主口腔龈下微生物群落组成结构［8］。据此，本研究采用16S rDNA 测序技术分析中重度牙周炎伴脑梗死患者龈下菌斑微生物群落结构特征及多样性，并初步探讨中重度牙周炎与脑梗死的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

筛选来自2021 年11 月～2023 年1 月某三甲医院口腔科就诊的中重度牙周炎患者10 例（PD 组），神经内科中重度牙周炎伴脑梗死患者10 例（CI-PD组）和体检的健康人群10 例（CK 组）。其中PD 组患者年龄35～58 岁，平均（45.90±10.63）岁，男性6例，女 性4 例；CI-PD 组 患 者 年 龄54～70 岁，平 均（60.30±5.44）岁，男性6 例，女性4 例；CK 组患者年龄43～57 岁，平均（50.00±5.35）岁，男性5 例，女性5 例。本研究获得医院医学伦理委员会审查批准（LW2021017），所有研究对象均签署知情同意书。1.1.1 纳入标准 35 岁≤年龄≤65 岁；至少有12颗牙齿存在，不包括第3 颗磨牙。

（1）牙周健康人群纳入标准：无全身系统性疾病，口腔卫生良好，牙龈颜色正常，无红肿出血溢脓，牙周袋探诊深度（probing depth，PD）＜3 mm，无临床附着丧失（clinical attachment loss，CAL）等。（2）中重度牙周炎纳入标准：参照《牙周病学》第四版教材①中度牙周炎：牙周袋≤6 mm，附着丧失3～4 mm，X 线片显示牙槽骨水平型或角型吸收超过根长的1/3，但不超过根长的1/2，牙齿可能有轻度松动，多根牙的根分叉区可能有轻度病变，牙龈有炎症和探诊出血或有脓；②重度牙周炎：牙周袋＞6 mm，附着丧失≥5 mm，X 线片显示牙槽骨吸收超过根长的1/2，多根牙有根分叉病变，牙多有松动，炎症较明显。（3）脑梗死纳入标准：需符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》的规定：①急性起病；②局灶性神经功能缺损（一侧面部或肢体无力或麻木，言语障碍等），少数为全面神经功能缺损；③影像学出现责任病灶或症状/体征持续24 h 以上；④排除非血管性病因；⑤脑CT/MRI 排除脑出血。

1.1.2 排除标准 近半年行牙周治疗者；复发性脑梗死、出血性脑卒中；长期使用抗生素及抗凝药物者；其他部位严重感染、血液病、传染性疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、冠心病史、肿瘤、严重肝、肾功能不全以及高血压患者；近3 个月服用任何影响系统性炎症指标的药物；1 个月内有大血管急性并发症；半年内有大的手术、外伤史；处于妊娠期、哺乳期。

1.2 实验方法

（1）记录基本信息；（2）牙周临床检查与记录：受检人群的剩余牙数（不计智齿）、牙周探诊深度、临床附着水平及探诊出血（bleeding on probing，BOP）；（3）拍摄曲面断层片；（4）龈下菌斑收集：受检人均在取样前3 h 内禁止饮食和刷牙，选取探诊最深的上颌第一磨牙和下颌第一磨牙的位点作为样本，先刮尽龈上菌斑，使用菌斑染色剂检测龈上菌斑去净后，嘱患者清水漱口，棉卷隔湿，气枪吹干牙面，使用无菌龈下刮治器刮取牙周袋内菌斑将其置于含1 mL PBS 的2 mL 无菌EP 管，并在冰浴条件下快速转移至1 000 r/min 离心机中离心5 min，弃上清液，留取沉淀，放入冰盒封存至-80 °C 冰箱中备用，送至广州华研基因科技有限公司运用Illumnia NovaSeq 6000 测序平台对16S rDNA V3-V4 区进行建库测序，使用Qiime（Version 1.9.1）、 R（Version 3.5.2）、mothur 及SPSS 等软件进行生物信息学分析。

1.3 统计学方法

采用GraphPad、SPSS 等软件进行数据分析，定性资料采用卡方检验，计量资料以（±s）表示，两组间进行比较时，使用Welch's T 检验和Wilcoxon秩和检验；多组间进行比较时，使用TukeyHSD 检验和Kruskal-Wallis 秩和检验；双变量之间差异性采用Anosim 相似性分析。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组间牙齿剩余数和牙周临床指标比较

通过对3 组间牙齿剩余数和牙周临床指标进行统计分析，得出CI-PD 组牙齿剩余数少于CK 组和PD 组，且与CK 组间差异具有统计学意义（P＜0.05）；CI-PD 组和PD 组的牙周探诊深度、探诊出血和临床附着丧失组间差异无统计学意义（P＞0.05），但两组均明显比CK 组严重，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 3 组间牙齿剩余数和牙周临床指标比较（n=10，±s）Tab 1 Comparison of the missing teeth and periodontal clinical index among the three groups（n=10，±s）

表1 3 组间牙齿剩余数和牙周临床指标比较（n=10，±s）Tab 1 Comparison of the missing teeth and periodontal clinical index among the three groups（n=10，±s）

注：与CK 组相比，*P＜0.05。

CAL(mm)0.000±0.000 2.825±0.874*3.350±1.460*134.604＜0.001组别CK 组PD 组CI-PD 组FP牙齿剩余数（颗）27.700±0.675 27.000±1.054 22.800±4.733*8.791 0.001 BOP(%)10.333±3.123 63.000±14.589*60.500±10.475*223.333＜0.001 PD(mm)0.250±0.439 2.950±0.714*3.025±0.800*129.177＜0.001

2.2 微生物群落结构分析

2.2.1 测序样本数据 对30 个龈下菌斑样本进行16S rDNA 测序，数据过滤后平均每个样本获得了76 588 条Clean reads，平 均 生 成70 166 条Effective tags。在97%的相似度水平下对序列进行聚类，共获得操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）数目为8 008，平均每个样本产生266 条OTU。

2.2.2 α 多样性分析 代表α 多样性的Observedspecies（Sob）指数和Shannon 指数表明PD 组样本α多样性显著大于CK 组（P＜0.05），其余组间样本α多样性无显著差异，提示健康人群患有牙周炎后龈下菌群微生物多样性会发生变化（图1、2）。对本研究30 个样本进行稀释曲线分析，随着测序深度增加，当序列数超过50 000 时，稀释性曲线总体趋于平缓，说明本研究龈下微生物群落的测序数据量合理（图3）。

图1 CK组、PD组、CI-PD组Observed-species指数比较图Fig 1 Comparison of Observed-species index among CK group， PD group and CI-PD group

图2 CK 组、PD 组、CI-PD 组Shannon 指数比较图Fig 2 Comparison of Shannon index among CK group，PD group and CI-PD group

图3 稀释曲线图Fig 3 Rarefaction curve

2.2.3 β 多样性分析 在不同组间微生物群落差异的β 多样性研究中，基于主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和相似性分析结果看出组间差异大于组内，PD 组与CI-PD 组（R=0.110 9）两组间样本接近，组间样本β 多样性差异无统计学意义（P＞0.05），可说明两组龈下菌斑物种组成相似度较高，而PD 组与CK 组（R=0.539 8）和CI-PD 组与CK 组（R=0.790 4）两组间样本均基本分开，组间β多样性有显著差异，具有统计学意义（P＜0.01），说明PD 组和CI-PD 组与CK 组中龈下菌斑物种组成相似度较低（图4）。

图4 基于样本间β 多样性指数的PCoA 散点图Fig 4 PCoA scatter plot based on β diversity index between samples

2.2.4 物种分布比较 （1）在PD 组和CI-PD 组中，门水平最多的物种是拟杆菌门（Bacteroidetes），其次是梭杆菌门（Fusobacteria）。而CK 组中，门水平最多的物种是放线菌门（Actinobacteria），其次是梭杆菌门（图5）。3 组人群中，在属水平上最多的物种均为梭杆菌属（Fusobacterium），但是PD 组和CIPD 组中第二多的物种为卟啉单胞菌属（Porphyromonas），CK 组中第二多的物种为放线菌属（Actinomyces）（图6）。

图5 3 组样本龈下菌群在门水平上的丰度Fig 5 The abundance of subgingival flora in three groups of samples at the phylum level

图6 3 组样本龈下菌群在属水平上的丰度Fig 6 The abundance of subgingival flora in three groups of samples at the genus level

（2）对3 组人群的龈下菌群物种分布进行交集分析，结果显示，3 组中共有OTU 数量为192 个，其中CK 组和CI-PD 组共有的OTU 数量仅为7 个，CK组和PD 组共有的OTU 数量41 个，PD 组和CI-PD组共有的OTU 数量53 个。CK 组、PD 组和CI-PD组独有的OTU 数量分别为40 个、28 个和101 个，显示了CI-PD 组龈下菌群物种丰富度最高，其次是CK 组，最低是PD 组。在菌属水平上，3 组共有的菌属 数 量 为52 个，CK 组、PD 组 和CI-PD 组 独 有 的 菌属为15 个、3 个和32 个。

2.2.5 不同组间差异菌群比较

2.2.5.1 3 组人群龈下菌群差异分析 在属水平上，CKvs.CI-PD、CKvs.PD 和PDvs.CI-PD 分别有23个、23 个和15 个差异物种（图7）。CKvs.CI-PD、CKvs.PD 分别有1 个和7 个特有差异菌属。其中，CKvs.PD、CKvs.CI-PD 和PDvs.CI-PD 有2 个共有差异物种奈瑟菌属和罗氏菌属，这2 个菌属在CK组中的丰度显著高于PD 组和CI-PD 组。

图7 龈下菌群属水平差异物种韦恩图Fig 7 Vene diagram of horizontal difference species of subgingival flora

结果显示，与CK 组相比，PD 组和CI-PD 组中卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、密螺旋体属、产丝菌属和TG5 显著增多；而放线菌属、棒状杆菌属、奈瑟菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、罗氏菌属、链球菌属和心杆菌属显著减少。此外，CI-PD 组的劳特普罗式菌属和嗜血杆菌属丰度显著低于CK 组。CI-PD 组与PD 组龈下菌群相比，CI-PD 组龈下菌群中的奈瑟菌属、劳特罗普氏菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、罗氏菌属、嗜血杆菌属、心杆菌属均显著低于PD组（表2）。

表2 3 组差异菌属丰度分析Tab 2 Analysis of the abundance of three groups of differential bacteria

2.2.5.2 ROC 曲线分析 受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析通过统计ROC 曲线下面积（area under curve， AUC）大小评估物种作为生物标记的正确性。在AUC＞0.5 的情况下，AUC 越接近于1，说明准确性越高。默认根据T 检验、秩和检验将PD 组、CI-PD 组分别与CK组间的显著差异物种逐一进行ROC 曲线分析，分别获得PD 组、CI-PD 组的微生物菌属生物标记（图8、9）。

图8 CK 组与PD 组的菌群标志物ROC 曲线Fig 8 ROC curve of flora markers in CK group and PD group

图9 CK 组与CI-PD 组的菌群标志物ROC 曲线Fig 9 ROC curve of flora markers in CK group and CIPD group

3 讨论

研究表明牙周炎和脑梗死之间存在关联［9］，然而，目前还缺乏基于龈下菌斑微生物群落讨论两者相关性的研究。16S rDNA 存在于所有生物体中，因其在结构和功能上具有高度的保守性，所以常被用于微生物测序。研究表明16S rDNA 的9 个可变区（V1-V9）中V3-V5 区较适于龈下菌群多样性的研究［10］。因此，本研究采用16S rDNA 的V3-V4 区测序技术对中重度牙周炎伴脑梗死患者的龈下菌斑微生物群落结构特征及多样性行初步研究。

本研究中，中重度牙周炎患者和中重度牙周炎伴脑梗死患者的龈下菌斑微生物群落结构较为相似，但两组龈下菌斑微生物多样性均较健康人群发生变化。与健康人群相比，中重度牙周炎患者和中重度牙周炎伴脑梗死患者的龈下菌群中拟杆菌门、卟啉单胞菌属、普雷沃氏菌属、密螺旋体属、互养菌属TG5 和纤毛菌属丰富度较高。同样，Park 等人采用高通量测序技术的研究表明牙周炎患者龈下菌斑中拟杆菌门、梭杆菌门、卟啉单胞菌属、梭杆菌属、二氧化碳嗜纤维菌属和密螺旋体属丰度较高，链球菌属和梭杆菌属在健康人群中丰度较高［11］。Tsai 等［12］采用qPCR 和16S rRNA 测序方法对重度慢性牙周炎患者的牙菌斑检测发现优势菌门属是厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌属、密螺旋体属和纤毛菌属。表明牙周炎核心微生物在不同牙周炎人群中相对稳定，且这些菌属的增加提示它们可能在中重度牙周炎和脑梗死中发挥作用。刘冬宇等对缺血性脑卒中伴慢性牙周炎患者与慢性牙周炎患者的龈下菌斑分析发现牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌及福赛坦氏菌分布无区别，但具核梭杆菌检出率与慢性牙周炎病变程度呈正比关系［13］。张阁等［14］发现福赛坦氏菌可能与缺血性脑卒中关系更密切。研究发现动脉粥样硬化斑块中检测的牙周致病菌主要是伴放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌、普雷沃氏菌及中间普氏菌等［15，16］。由于本研究测序鉴定是龈下菌群门属水平，未来研究可进行宏基因测序鉴定到菌种水平，进一步探索缺血性脑卒中伴中重度牙周炎患者的龈下菌群优势菌种与脑梗死之间相关性。此外，体外及动物体内研究发现卟啉单胞菌属中的牙龈卟啉单胞菌可以通过影响内皮细胞黏附分子、促炎细胞因子和趋化因子等表达，从而进一步促进内皮功能障碍导致动脉粥样硬化［17，18］。

本研究发现中重度牙周炎患者和中重度牙周炎伴脑梗死患者的龈下菌斑中放线菌属、棒状杆菌属、奈瑟菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、罗氏菌属、链球菌属和心杆菌属的丰度显著低于健康人群，而健康人群中奈瑟菌属和罗氏菌属的丰度相对较高，与先前研究结果一致［19，20］。这些菌属的减少表明中重度牙周炎和脑梗死可能与正常牙周菌群的失衡有关，导致为宿主提供保护作用的一些有益菌属减少，正常菌群内的失衡使宿主容易受到病原菌的攻击，这可能增加中重度牙周炎和脑梗死的风险。

本项研究值得注意的是中重度牙周炎伴脑梗死患者的龈下菌斑中奈瑟菌属、劳特罗普氏菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、罗氏菌属、嗜血杆菌属和心杆菌属的丰度较中重度牙周炎患者更低。提示这些菌属在龈下菌斑微生物群落中的低丰度可能在脑梗死疾病中起着重要作用。

当微环境发生变化时，龈下菌斑微生物群落稳态失衡，而微生物群落和宿主之间存在相互影响的关系，不平衡的微生物群落影响宿主的反应，导致炎症水平发生变化，不仅推动牙周炎的发生、发展，而且可能是牙周炎与脑梗死之间关联的关键纽带。另外，研究发现积极控制牙周菌斑可以对脑梗死和牙周炎的防治产生积极影响［21，22］。

综上所述，本研究分析了中重度牙周炎人群、中重度牙周炎伴脑梗死人群及牙周健康人群龈下菌斑微生物群落结构和物种多样性，这为进一步了解牙周炎及脑梗死人群的龈下微生物群落与宿主相互作用提供一定的参考内容。牙周炎人群龈下微生物的改变与脑梗死的因果关系目前仍无法得出结论，未来的研究需要在加大样本量基础上，结合蛋白质组学和代谢组学技术的多组学研究方法，对微生物组在不同条件下的优势菌群及产生的功能蛋白质和代谢物进行分析，将有助于在牙周炎的早期发现潜在的生物标志物，以及了解复杂的龈下微生物群落的失衡对脑梗死主要病理基础动脉粥样硬化形成的机制和程度的影响。

作者贡献度说明：

钟晓雪：实验设计，数据收集，执笔撰写；王慧：实验设计，数据收集；陈敏哲、常睿：数据整理及分析；贺小宁：审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。