肺腺癌患者癌组织人内源性逆转录病毒-H长末端重复关联蛋白2、淋巴细胞活化基因3、整合连接激酶表达情况及与临床病理特点的关系

董亮亮 童春堂 郑明旭 李书阅

肺腺癌(LUAD)是非小细胞肺癌(NSCLC)最常见的亚型,具有高度浸润和破坏性,其5年生存率仅为30%～60%[1-2]。近来免疫治疗成为了肿瘤治疗的热点[3],人内源性逆转录病毒-H长末端重复关联蛋白2(HHLA2)为T淋巴细胞共抑分子,参与相关细胞因子的分泌调节、维持免疫环境稳定及肿瘤进展过程[4]。淋巴细胞活化基因3(LAG-3)具有负性调节T淋巴细胞的功能,参与多种肿瘤细胞的免疫逃逸过程[5]。整合连接激酶(ILK)可与整合素细胞浆域结合,参与多种恶性肿瘤细胞的粘连、生长和血管生成等过程[6]。基于此,本研究检测LUAD患者癌组织HHLA2、LAG-3、ILK表达水平,分析其与临床病理的关系,为临床治疗提供参考。

对象与方法

1.对象:选择2017年9月～2019年9月来我院就诊的LUAD患者106例,其中男61例、女45例,年龄35～79岁,平均年龄(61.05±7.12)岁。纳入标准:(1)均经组织病理检查确诊为LUAD;(2)预计生存时间>6个月;(3)临床相关资料完整。排除标准:(1)合并其他器官肿瘤;(2)术前行放、化疗;(3)伴心脏、肾脏等严重功能障碍;(4)存在先天性肺功能异常或肺部感染性疾病;(5)存在治疗不耐受。本研究已通过我院伦理委员会审核,所有患者及家属均签订知情同意书。

2.方法

(1)癌组织及癌旁组织病理观察:HE染色:经手术取LUAD患者肺腺癌组织及癌旁组织,行常规标本固定、包埋等处理,HE染色后于显微镜下观察。免疫组织化学染色:采用SP法,组织芯片常规切片、烤片、脱蜡,水化后PBS冲洗;行抗原封闭,PBS冲洗,经3%H2O2充分消除过氧化酶,加入稀释后的一抗,4 ℃冰箱下过夜;去除一抗,PBS冲洗,加入鼠兔通用二抗,孵育后去除二抗,PBS冲洗;再行显色、复染等步骤,最后用中性树胶及盖玻片封片备用,于显微镜下观察。参考Imielinski等[7]标准,采用阳性区域(AP,0～4分)及染色强度(IS,0～4分)来评价HHLA2、LAG-3、ILK的表达水平,出现棕黄色颗粒为HHLA2(细胞膜和细胞质)、LAG-3、ILK(癌细胞细胞质内)表达阳性细胞。强度分布(ID,分)=AP×IS,ID<4分为低表达,ID≥4分为高表达。

(2)观察指标:收集所有患者的一般资料及临床病理资料,包括性别、年龄、组织分化程度(低分化、中分化、高分化)、TNM分期(Ⅰ～Ⅳ期)、肿瘤直径、淋巴结转移及远处转移情况。采用门诊及电话对所有患者进行随访,每3个月1次,记录患者生存情况,随访时间截至2022年9月。

3.统计学处理:应用SPSS 20.0软件进行统计分析。计数资料以例数和百分比表示,组间比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.LUAD患者肺腺癌组织及癌旁组织中HHLA2、LAG-3及ILK表达情况比较:LUAD患者癌组织中HHLA2、LAG-3、ILK高表达分别为85例(80.19%,HHLA2高表达组)、65例(61.32%,LAG-3高表达组)及78例(73.58%,ILK高表达组),低表达分别为21例(19.81%,HHEA2低表达组)、41例(38.68%,LAG-3低表达组)及28例(26.42%,ILK低表达组);上述3项指标在LUAD患者癌旁组织中高表达分别为14例(13.21%)、8例(7.55%)及26例(24.53%),低表达分别为92例(86.79%)、98例(92.45%)及80例(75.47%)。LUAD患者癌组织中HHLA2、LAG-3、ILK高表达患者比例均高于同指标低表达患者比例,癌旁组织中上述3项指标低表达患者比例均高于同指标高表达患者比例。

2.HHLA2高表达组与HHLA2低表达组患者一般资料及临床病理资料比较:两组患者性别、组织分化程度、TNM分期、肿瘤直径、远处转移情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)。HHLA2高表达组年龄≥60岁、淋巴结转移患者比例均高于HHLA2低表达组(P<0.05)。见表1。

表1 HHLA2高表达组与HHLA2低表达组患者一般资料及临床病理资料比较[例,(%)]

3.LAG-3高表达组与LAG-3低表达组患者一般资料及临床病理资料比较:两组患者性别、年龄、组织分化程度、肿瘤直径比较差异均无统计学意义(P>0.05)。LAG-3高表达组TNM Ⅲ、Ⅳ期、淋巴结转移、远处转移患者比例均高于LAG-3低表达组(P<0.05)。见表2。

表2 LAG-3高表达组与LAG-3低表达组患者一般资料及临床病理资料比较[例,(%)]

4.ILK高表达组与ILK低表达组患者一般资料及临床病理资料比较:两组患者性别、年龄、肿瘤直径比较差异均无统计学意义(P>0.05)。ILK高表达组组织低分化、TNM Ⅲ、Ⅳ期、淋巴结转移、远处转移患者比例均高于ILK低表达组(P<0.05)。见表3。

表3 ILK高表达组与ILK低表达组患者一般资料及临床病理资料比较[例,(%)]

5.HHLA2、LAG-3、ILK表达与LUAD预后的关系:随访3年,106例患者中存活42例,总生存率为39.62%。HHLA2低表达组3年生存率(61.90%)高于HHLA2高表达组(34.11%);LAG-3低表达组3年生存率(53.66%)高于LAG-3高表达组(30.77%);ILK低表达组3年生存率(57.14%)高于ILK高表达组(33.33%),差异均有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

LUAD在确诊时大多已是晚期,采用化疗、放疗等传统治疗方式疗效均不理想。随着医学研究进展,免疫检查点疗法被认为是阻止肿瘤免疫逃逸的重要方法,但最后多数患者因耐药而复发,因此寻求LUAD新的免疫检查点很有必要[8]。

HHLA2主要表达于人抗原呈递细胞和T细胞,具有免疫监视、辅助T细胞激活等作用[9]。相关研究结果表明,HHLA2可能与胃癌疾病进展及预后相关[10]。本研究中,HHLA2主要表达于肿瘤细胞的细胞膜及细胞质,在LUAD患者癌组织中呈高表达,且其表达水平与年龄、淋巴结转移有一定关系,提示HHLA2参与了LUAD的发生及发展,可能机制为:(1)HHLA2可与未知受体结合,减弱机体的抗肿瘤免疫应答;(2)HHLA2可与其受体TMIGD2结合,通过AKT依赖性信号级联共刺激T细胞增殖,促进相应细胞因子产生,同时还能影响肿瘤血管内皮生成[11-12]。随访3年,所有患者中共存活42例,总生存率为39.62%,HHLA2低表达组3年生存率高于HHLA2高表达组,提示HHLA2水平与LUAD预后相关。

LAG-3属于免疫球蛋白家族,在多种肿瘤微环境中均异常表达,与肿瘤生长与发展相关[13]。本研究中,LAG-3表达于肿瘤浸润淋巴细胞的细胞质及细胞膜上,且呈高表达,其表达水平与患者的TNM分期、淋巴结转移、远处转移相关;同时发现,LAG-3低表达组患者3年生存率高于LAG-3高表达组,说明LAG-3可能参与了LUAD的进展,并与患者的生存率相关,分析相关机制如下:(1)LAG-3可和主要组织相容复合体Ⅱ(MHC-Ⅱ)结合,起到负性调控T细胞的作用,维持内环境稳定;(2)LAG-3促进Treg分化,使其发挥免疫抑制作用[14]。

ILK是最受关注的新兴免疫靶点之一,可与多种蛋白结合,在胃癌、乳腺癌、结肠癌等研究中均认为ILK具有癌基因性质[15]。本研究中,ILK表达于癌细胞细胞质内,且呈高表达;进一步发现,ILK表达水平与组织分化、TNM分期、淋巴结转移、远处转移相关,同时ILK低表达组3年生存率高于ILK高表达组,提示ILK可能参与疾病进展,并与预后相关。分析ILK参与肿瘤进展可能是:(1)通过下游靶蛋白如核转录因子(NF)-κB通路、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等,参与调节细胞粘连、迁移及血管生成等过程;(2)通过与整合素结合,激活AMPK、PI3K/Akt等信号通路,影响细胞周期、促进细胞增殖,进而影响肿瘤进程[16-17]。当然本研究还存在一定不足:样本量选择较少,研究时间有限,且对于HHLA2、LAG-3、ILK与LUAD具体作用机制探讨尚不够全面,后期将联合多中心、扩大样本量,进行深入研究。

综上,HHLA2、LAG-3、ILK在LUAD患者癌组织中大部分呈高表达,且与临床病理特点、预后存在一定关系,可作为肿瘤治疗的药物靶点。