肿瘤抑制基因7L通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胰腺癌细胞生长的作用机制

陈小丽 田小容 黄晓东 田霞

胰腺癌是最致命的癌症之一,我国胰腺癌的发病率和死亡率仍在逐年上升,对人类健康构成重大威胁[1-2]。因此,探索胰腺癌发生、发展的分子机制,寻找新的治疗靶点,对改善胰腺癌患者的预后尤为重要[3-4]。研究表明肿瘤抑制基因(ST)7L通过调控Wnt/β-catenin信号通路起肿瘤抑制作用并被表征为抑癌基因[5-6]。曲美他嗪可通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制人脑血管平滑肌细胞的增殖、迁移及活性氧表达[7]。当Wnt通路被激活时,β-catenin磷酸化被抑制,导致细胞中β-catenin增加,β-catenin蛋白转位到细胞核中,与转录因子的共调节因子形成复合物,共同激活Wnt靶基因的转录,最终参与促进细胞增殖、存活、分化和迁移等基因表达[8-9]。研究发现ST7L基因能够作为靶基因,在上游基因的调控下参与胰腺癌细胞生长、转移和耐药。然而,关于ST7L对胰腺癌细胞增殖及凋亡能力影响的报道甚少。因此,本研究主要探讨ST7L对胰腺癌细胞增殖和凋亡能力的影响及其可能的作用机制,以期为胰腺癌的治疗提供新依据。

材料与方法

1.材料:临床样本:选取于我院就诊、病理组织活检确诊为胰腺癌且未行放化疗的患者及同期健康体检者血浆标本各22例,同时收集胰腺癌组织和癌旁组织(距癌组织边缘≤3 cm)标本13对。取血浆标本在4 ℃下1 000 g离心15 min,随后转移至-80 ℃冰箱保存。组织标本离体后先液氮速冻,后储存于-80 ℃备用。本研究经我院伦理委员会审核批准(KY2019-012),所有受试者均签署知情同意书。主要试剂:DMEM、RPMI 1640培养基及胎牛血清均购于美国Gibco公司;Trizol及Lipofectamine2000试剂购于美国Invitrogen公司;逆转录反应试剂盒购于日本TOYOBO公司;UltraSYBR混合物购于江苏康为世纪公司;ST7L和β-actin引物购于广州锐博公司;细胞计数试剂盒8(CCK-8)购于上海碧云天公司;ST7L抗体购于美国Sigma公司;Caspase-3抗体购于美国CST公司;Bcl-2抗体购于美国R&D公司;β-catenin、c-Myc、Cyclin D1及β-actin抗体均购于英国Abcam公司。

2.方法

(1)细胞培养:人胰腺癌细胞系PANC-1、PaCa-2、AsPC-1和胰腺导管正常细胞H6C7均来源于中国科学院细胞库。PANC-1和PaCa-2生长于DMEM培养基,AsPC-1和H6C7生长于RPMI 1640培养基,所有细胞在37 ℃、含5%的CO2的培养箱中进行培养,培养细胞的完全培养基均含有1%青-链霉素及10%胎牛血清。

(2)RNA的提取及实时荧光定量(qRT)-PCR:总RNA的提取使用Trizol试剂,随后将其逆转录为cDNA,在20 μl反应体系中进行定量PCR,操作步骤均按照试剂盒说明书进行,ST7L基因mRNA水平按照2-ΔΔCT法通过β-actin进行内源性校正。qRT-PCR用于检测临床样本及细胞系中ST7L的表达水平。

(3)细胞转染及分组:将细胞接种于6孔板,第2天细胞大部分融合后,使用Lipofectamine2000试剂,将ST7L过表达质粒及空白质粒分别转染胰腺癌细胞作为ST7L组和对照组,将ST7L敲降质粒及空白质粒分别转染胰腺癌细胞作为si-ST7L组和si-NC组。转染步骤严格按照说明书进行。

(4)CCK-8检测:将细胞接种于96孔板,待细胞贴壁相应时间后,向每孔培养液中加入10 μl的CCK-8溶液,充分混合,分别检测细胞在24 h、48 h、72 h、96 h于450 nm的OD值,反映各组细胞的增殖情况。

(5)流式细胞术:流式细胞术用于分析细胞的凋亡情况,将细胞接种于6孔板,培养3天后,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI),室温避光条件下孵育15 min,所有样品在1 h内使用FACSCalibur Ⅱ流式仪进行检测分析。

(6)Western blot:用细胞裂解液从各组细胞中提取总蛋白,将蛋白与上样缓冲液混合后100 ℃变性10 min,用10% SDS-PAGE胶分离每个样品中等量的蛋白质提取物并转移到PVDF膜上,随后与相应一抗4 ℃孵育过夜,用羊抗兔二抗在室温下孵育1 h,随后使用ECL发光显色试剂盒进行显色显影,成像仪曝光扫描分析结果。

结 果

1.ST7L在胰腺癌患者血浆、组织及胰腺癌细胞系中的表达情况:胰腺癌患者血浆ST7L表达水平明显低于健康对照者[(5.64±3.34)比(10.27±7.94),P<0.05]。胰腺癌组织中ST7L的表达水平显著低于对应癌旁组织[(5.31±2.89)比(12.63±10.36),P<0.05]。ST7L在胰腺癌细胞系PANC-1、AsPC-1、PaCa-2中的表达水平明显低于胰腺导管正常细胞H6C7[(0.25±0.03)、(0.41±0.04)、(0.18±0.03)比(0.58±0.07),P<0.05]。

2.ST7L对胰腺癌细胞增殖和凋亡能力的影响:ST7L组及对照组细胞24 h、48 h、72 h及96 h的增殖能力均依次升高,ST7L组细胞24 h、48 h、72 h及96 h的增殖能力均明显低于同期对照组(P<0.05),见表1。ST7L组PANC-1及PaCa-2细胞凋亡率均高于对照组[(34.14±0.61)比(10.67±0.52)、(25.89±0.48)比(13.64±0.70),P均<0.05]。ST7L组PANC-1及PaCa-2细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平均高于对照组[(0.64±0.13)比(0.17±0.04)、(0.55±0.08)比(0.25±0.03),P均<0.05],而Bcl-2表达水平均低于对照组[(0.06±0.02)比(0.57±0.10)、(0.38±0.05)比(0.74±0.08),P均<0.05]。

表1 ST7L组及对照组胰腺癌细胞增殖能力比较

3.4组胰腺癌细胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表达水平比较:ST7L组细胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表达均低于对照组;si-ST7L组细胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表达均高于si-NC组(P<0.05)。见表2。

表2 4组胰腺癌细胞β-catenin、c-Myc和Cyclin D1表达水平比较

讨 论

由于胰腺癌隐匿的临床病程和不明确的症状,诊断通常较晚。一项多中心研究表明,通过早期筛查检测到的胰腺癌患者5年生存率为73.3%、中位生存时间为9.8年,而非筛查发现的胰腺癌患者的生存率为1.5年[10]。有研究发现,约5%～10%的胰腺癌是由已知基因突变或具有家族聚集引起的[11]。本研究从胰腺癌发生发展的分子机制出发,探讨ST7L对胰腺癌细胞增殖及凋亡能力的影响,以期为胰腺癌的治疗提供新思路。

近年来ST7L被发现在多种肿瘤中表达下调,包括肺癌[12]、乳腺癌[13]和肝细胞癌[14],提示ST7L在肿瘤的发生发展中扮演重要角色。我们前期研究发现ST7L作为微小RNA(miRNA)-331-3p的新型靶基因,可减弱miR-331-3p诱导的细胞增殖和上皮间充质转化(EMT)介导的体外转移[15]。然而,ST7L对胰腺癌细胞增殖和凋亡能力的影响及作用机制仍未见报道。本研究发现ST7L在胰腺癌患者血浆、组织及胰腺癌细胞系中的表达水平明显降低,由于ST7L在PANC-1和PaCa-2中的表达明显降低,且两者均为高侵袭性人胰腺癌细胞系,因此我们选择两者作进一步研究,结果表明ST7L可抑制胰腺癌细胞增殖,促进胰腺癌细胞凋亡。为了进一步探讨ST7L发挥作用的分子机制,我们发现过表达ST7L可抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,而抑制ST7L的表达可激活Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路是一种高度保守的进化途径,参与调节关键的细胞功能,越来越被认为是抗癌治疗的潜在重要靶点[16-17]。Wnt通路的异常激活是不同类型恶性肿瘤的基础,包括结直肠癌[18]、乳腺癌[19]和肝癌[20]等。研究表明miR-489-3p可通过靶向PR结构域蛋白5抑制Wnt/β-catenin信号通路,调控人急性髓系白血病细胞系U937的迁移和侵袭[21]。当Wnt通路被激活时,β-catenin磷酸化被抑制导致细胞中β-catenin增加并转位到细胞核中,促进癌基因如c-Myc、Cyclin D1的转录,最终促进细胞增殖、分化和迁移等基因的表达[22]。为了探讨ST7L对Wnt/β-catenin信号通路的作用,我们检测了其主要成分β-catenin及关键下游效应分子c-Myc和Cyclin D1的表达,结果表明ST7L可减弱β-catenin、c-Myc和Cyclin D1的表达,提示ST7L在胰腺癌细胞中可能通过降低Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达来发挥抑癌作用。然而ST7L抑制胰腺癌细胞生长的具体机制,干预其表达能否影响胰腺癌的发展并应用于临床等问题还需进一步研究。

综上,本研究表明ST7L在胰腺癌中低表达,可能通过降低Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达来发挥抑癌作用,基于ST7L/Wnt/β-catenin信号轴的干预可能为胰腺癌的临床治疗提供分子基础和实验依据。