病原菌血流感染对阿尔茨海默病小鼠记忆力和海马锥体细胞的影响*

姚昌昊, 周晓明, 康颖倩*

(1.贵州医科大学 基础医学院 微生物学教研室, 贵州 贵阳 550025; 2.贵州省普通高校病原生物学特色重点实验室, 贵州 贵阳 550025; 3.贵州医科大学 环境污染与疾病监控教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550025; 4.贵阳市妇幼保健院 质控科, 贵州 贵阳 550003)

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)作为一种老年痴呆疾病,发病往往较为隐匿,呈缓慢进行性发展,早期以近记忆功能下降为主,随病程的进展逐渐造成远记忆功能受损,主要表现为记忆障碍、语言功能减退及视空间障碍为主[1];进而引起患者日常生活能力下降,中晚期出现幻觉、妄想、行为失常、睡眠障碍等神经精神症状,容易合并深部感染[2]。近年来,我国人群年龄结构出现老年人群占比越来越高的情况,因此AD患者人数也明显增多,对患者家庭以及社会层面都带来了巨大压力[3-5]。有数据显示,目前,全球有近5 000万AD患者,并预判30年后将新增15 200万AD患者,AD 已成为全球第5大死因[6-7]。AD模型小鼠的造模方法众多,其中化学方法造模较为常见[8]。D-半乳糖(D-galactose)是一种还原性单糖物质,可致大脑出现认知功能和胆碱能功能障碍,原因是其可迅速升高大脑组织渗透压,介导氧化应激及炎症反应,因此通过腹壁皮下连续注射D-半乳糖可建立AD模型小鼠[9]。目前关于AD小鼠尾静脉感染自AD患者来源的病原菌研究国内报道较少,因此,本研究拟探讨AD患者合并感染的病原菌经尾静脉注射AD模型小鼠形成血流感染后对其记忆和海马结构的影响,为AD患者的治疗提供实验室参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物和菌株来源 2月龄、体质量18～22 g的C57BL/6J雄性小鼠50只,购于成都达硕实验动物有限公司[SCXK-(川)2020-030],采用SPF级辐照维持饲料(北京科澳协力饲料有限公司)饲养于SPF级标准动物房中,确保食物和饮水供应充足,饲养于温度20～26 ℃、湿度40%～50%的环境中,12 h昼夜交替照明,小鼠每日自由进食和饮水,饲养及使用程序均严格遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》要求规范,并获学校实验动物伦理委员会的批准(N2200384);成都某医院综合内科住院、确诊为AD合并深部感染患者的痰液、血液及尿液中提取的5种数量较多并具有一定代表意义的病原菌,分别为大肠埃希菌(SYY001)、铜绿假单孢菌(SYY002)、肺炎克雷伯杆菌(SYY003)、金黄色葡萄球菌(SYY004)及白念珠菌(SYY005),5种菌株均保存于15%甘油管中并储存于-20 ℃冰箱。

1.1.2主要试剂和仪器 D-半乳糖(南京都莱生物技术有限公司,纯度99%,100 g/瓶),LB固体培养基、营养琼脂、麦康凯琼脂培养基、血平板及沙氏琼脂培养基(北京索莱宝生物科技有限公司);SW-CJ-IF型超净工作台(上海一恒科学仪器有限公司),Morris水迷宫系统(诺达思北京信息技术有限公司),高压蒸汽灭菌锅(上海医疗设备厂),DHP-9902型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司),AUW220型电子天平(日本岛津仪器有限公司),震荡切片机(上海之信仪器有限公司),KH-TK型组织脱水机(湖北阔海医疗科技有限公司),PBM-A型病理组织包埋冷冻台(常州普瑞斯星医疗设备公司),RM2125型轮转式切片机(上海徕卡仪器有限公司),ECLIPSE Series型普通光学显微镜(日本尼康公司),数字切片扫描仪Pannoramic 2503DHISTECH(Hungary),KH-01型麦氏比浊仪(北京海富达科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1小鼠造模及体质量测定 50只C57BL/6J雄性小鼠第1周适应性饲养,第2周开始使用D-半乳糖按200 mg/(kg·d)腹部皮下注射造模[10]。D-半乳糖溶液配置方法为生理盐水7 mL加D-半乳糖0.2 g于烧杯中,玻璃棒搅拌均匀,倒入试剂瓶;取无菌生理盐水3 mL冲洗烧杯及玻璃棒,冲洗液全部倒入试剂瓶中;每天使用医用无菌注射器腹壁皮下注射配制好的D-半乳糖液0.2 mL,注射时间为8周[11]。造模期间每周观测小鼠的一般状态及体质量。

1.2.2菌株复苏 造模结束后,将大肠埃希菌、铜绿假单孢菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌及白念珠菌统一复苏后传至第2代备用。其中,大肠埃希菌使用LB固体培养基进行复苏培养,铜绿假单胞菌及肺炎克雷伯杆菌使用麦康凯琼脂培养基进行复苏培养,金黄色葡萄球菌使用血平板进行复苏培养,白念珠菌使用SDA培养基进行复苏培养。严格按照《全国临床检验操作规程》第4版要求进行[12]。

1.2.3小鼠分组及体质量、体温测定 取“1.2.2”项下传至第2代的5种病原菌,使用麦氏比浊仪配置菌液为0.5麦氏浓度(1.5×1011CFU/L)后备用,此为原始浓度。因课题组前期预实验5种病原菌菌液原始浓度为1.5×1011CFU/L时感染AD模型小鼠死亡,而5种病原菌菌液浓度为1.5×108CFU/L时感染AD小鼠观察14 d后仍存活。为避免小鼠死亡,按照参考文献[13-16]方法将5种病原菌的菌液浓度稀释为1.5×109CFU/L(高浓度)、1.5×108CFU/L(中浓度)及1.5×107CFU/L(低浓度)进行实验,每种病原菌菌液有3个浓度,每个浓度3只小鼠重复。5组病原菌感染组的小鼠注射相应菌液,对照鼠小鼠注射无菌生理盐水,且每只小鼠均采用尾静脉注射法注射相应液体0.2 mL;5个病原菌感染组分别是大肠埃希菌组(9只)、铜绿假单孢菌组(9只)、肺炎克雷伯杆菌组(9只)、金黄色葡萄球菌组(9只)及白念珠菌组(9只),且同一菌株按前述浓度分为高浓度组、中浓度组及低浓度组;观察14 d,分别于注射后第1、2、3天及第1、2周测定各组小鼠的体质量及体温[17]。

1.2.4水迷宫实验 取“1.2.3”项下实验结束时各组小鼠进行Morris水迷宫实验。实验开始前将所有小鼠置于水迷宫系统实验室,以便小鼠适应实验室环境,避免受惊。前5 d为定位航行实验,其主要用来评价小鼠的学习记忆功能;第2～5天,将平台置于水平面下1 cm位置,其余操作同第1天;定位航行实验结束 24 h 后,撤除水下平台,任选 1 个入水点将小鼠面向池壁放入水中,各组小鼠必须在同一入水点,记录小鼠在120 s 内第1次跨越平台时间、跨越平台次数等指标[18]。

1.2.5海马组织学特征观察 取“1.2.4”项下实验结束时各组小鼠禁食12 h,称取空腹体质量;脱颈处死各组小鼠,冰上解剖,取头颅、剪开皮肤暴露颅骨、镊子夹住两侧眼眶用眼科剪稍减除颅骨中线,清晰可见后全脑组织,使用无菌眼科镊去除脑膜和血管,竹签从嗅球处向下取出全脑[18];脑组织移至冰上切割,使用无菌眼科镊及玻璃分针缓慢的将一侧大脑皮层拨开,暴露出海马组织,取出两侧海马,4 ℃的0.9%生理盐水清洗,定性滤纸吸干海马表面的生理盐水;采用10%多聚甲醛溶液固定过夜,石蜡包埋、切片后常规苏木精-伊红(HE)染色,普通光学显微镜下观察海马CA1及CA3区(200倍),用数字切片扫描仪扫描后采图。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

造模到第8周时,50只模型小鼠活动度逐渐减慢、触须脱落,毛色枯黄、光泽度下降,皮肤松弛,体质量开始下降,进食减少,且精神状况较造模初期明显下降。见图1。

图1 D-半乳糖干预小鼠8周的体质量变化Fig.1 Changes in body mass of mice treated with D-galactose for 8 weeks

2.2 体质量及体温变化

随着观察时间的延长,对照组与各病原菌感染组小鼠的体质量均有所增加,其中对照组小鼠体质量增加速度最快;5种病原菌感染组小鼠体质量增加速度均低于对照组;5种病原菌感染组的小鼠体温前3 d呈轻度上升趋势;第1周,除肺炎克雷伯菌组小鼠体温仍有轻度上升,其余各组小鼠体温均呈下降趋势;第2周各组小鼠体温值变化不大,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组AD小鼠体质量和体温的变化

2.3 水迷宫实验

随着训练天数的增加,对照组小鼠的逃避潜伏期于第2 天轻度上升,第3～5天均表现为逐渐下降的趋势;与第4 天相比,第5天5种病原菌低、中及高浓度感染组小鼠的逃避潜伏期时间均缩短(P<0.05,图2);第1～5天肺炎克雷伯菌高浓度组小鼠随着训练天数的增加,游泳速度逐渐减慢。与对照组相比,第5天该菌高浓度组小鼠游泳速度显著下降(P<0.01,图3);5组病原菌中浓度感染组小鼠游泳速度整体比较,差异无统计学意义(P>0.05,图3)。与第4天相比,第5天金黄色葡萄球菌中浓度感染组小鼠游泳速度明显提高(P<0.01,图3);5组病原菌低浓度感染组小鼠游泳速度比较,差异无统计学意义(P>0.05,图3);各组小鼠120 s穿越平台次数整体比较,差异无统计学意义(P>0.05,图4)。

图2 各组小鼠水迷宫实验的平台逃避潜伏期变化Fig.2 Water Maze experimental platform escapes incubation period

图3 各组小鼠水迷宫实验的游泳速度变化Fig.3 Changes in swimming speed in water maze test of mice in each group

图4 各组小鼠水迷宫实验120 s的穿越平台次数Fig.4 Times of crossing the platform of each group in water maze experiment for 120 s

2.4 海马组织学特征

HE染色结果显示(图5),对照组小鼠海马CA1和CA3区海马锥体细胞形态规则、排列整齐、细胞间隙未见明显异常,金黄色葡萄球菌组和大肠埃希菌组小鼠海马CA1和CA3区部分海马锥体细胞排列紊乱、细胞间隙增宽、胞体深染,铜绿假单胞菌组和肺炎克雷伯菌组小鼠海马CA1和CA3区海马锥体细胞有少许颗粒空泡变性,白念珠菌组小鼠海马CA1和CA3区见海马锥体细胞凋亡。

图5 各组小鼠海马CA1和CA3区组织学特征(HE,×200)Fig.5 Histological characteristics of hippocampal CA1 and CA3 regions in each group of mice(HE,×200)

3 讨论

D-半乳糖腹壁皮下注射小鼠造模是一种成熟的化学造模方法,因操作较为方便且成本较低而被广泛应用,其原理是D-半乳糖能够使大脑正常神经细胞的代谢功能受到抑制,从而导致小鼠痴呆[19-20]。研究显示,D-半乳糖引起细胞代谢紊乱,是由于其所产生的代谢产物半乳糖醇能够引起细胞代谢紊乱,产生大量的活性氧,造成多器官、多系统功能衰退[21]。此外,D-半乳糖还可以引起大脑组织炎症因子释放增加。本研究采用D-半乳糖[200 mg/(kg·d)]腹壁皮下注射小鼠,结果显示注射8周后小鼠毛发脱落光泽度下降、皮肤松弛、体质量开始下降,小鼠活动情况较造模之初明显迟缓。

本研究将临床AD患者来源的病原菌经尾静脉注射AD小鼠并观察14 d后,对各组小鼠进行了水迷宫实验,结果显示,铜绿假单胞菌组、肺炎克雷伯菌组、金黄色葡萄球菌组及白念珠菌组小鼠逃避潜伏期较对照组有所延长,同一种病原菌感染组小鼠中有的表现为高浓度组小鼠游泳速度较对照组更慢,有的表现为低浓度组小鼠逃避潜伏期较对照组更长。潜伏期时间的长短与小鼠尾静脉注射感染的病原菌种类有关,与病原菌的浓度无明确的相关性,提示不同类型的病原菌均能够产生相应的毒力,从而对AD小鼠的学习记忆能力产生一定的影响。水迷宫实验120 s时,各组AD小鼠穿越平台次数无差异,提示病原菌感染种类的不同对AD小鼠穿越平台的次数无影响。相关研究认为,血脑屏障中控制大分子物质进出大脑的通道由微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞组成,对中枢神经系统起到一定的保护[22]。本研究结果提示,临床AD患者来源的病原菌通过尾静脉注射AD小鼠后,可经血脑屏障进入中枢神经系统,对小鼠的学习记忆功能产生损害。

注射病原菌菌液后观测各组小鼠的体温情况,结果显示,5种病原菌感染组小鼠及对照组小鼠的体温值均在正常范围内波动,大肠埃希菌组小鼠的体温值波动较大;5种病原菌感染组小鼠体质量的波动情况较对照组低1～2 g,分析可能原因是AD患者来源的病原菌可产生相应毒力及致病因子,从而引起小鼠体温升高及饮食减少。相关研究发现,某些特定的细菌和真菌感染可引起中枢系统感染,部分细菌入侵大脑是通过穿越血脑屏障实现的[23]。感染期间,中枢神经系统的损伤引起炎症介质的释放和免疫系统的激活,炎症介质可透过损伤的血脑屏障及受损的细胞膜,进一步导致大脑内氧化应激损伤,加重神经退化[24]。近些年来,AD患者中的真菌感染也受到越来越多学者的关注[25-26]。

本研究选用临床来源的5种AD患者合并深部感染常见的病原菌。其中,白念珠菌的致病机理尚不明确;铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌,其毒力主要与鞭毛和菌毛、Ⅲ型分泌系统、群体感应系统等因素相关[27];肺炎克雷伯杆菌多与其自身存在的毒力因子及毒素密切关联;大肠埃希菌的毒力主要是与细胞粘附、生物被膜、铁摄取相关以及毒素类致病因子等;金黄色葡萄球菌的毒力则包括凝集因子A、胞外分泌型蛋白、血浆凝固酶及金黄色葡萄球菌肠毒素等,这些毒素可造成人体多器官损害,危及生命[28-29]。

本研究中AD模型小鼠海马组织学结果显示,部分病原菌感染组小鼠海马CA1及CA3区出现锥体细胞排列紊乱和颗粒空泡变性,推测锥体细胞变性程度可能与小鼠感染病原菌的种类有关,提示不同的病原菌因各自的毒力不同,从而对海马组织神经元细胞产生不同的影响;白念珠菌组中部分小鼠海马锥体细胞有凋亡的表现,推测毒力越强的病原菌对小鼠海马组织的影响更大。近年有研究提示,学习记忆功能减退与脑内神经元数目减少及神经元突触的可塑性变化有关[30]。

本研究结果表明,病原菌血流感染可以引起AD小鼠学习记忆功能下降,可能是病原菌的毒力及致病因子加重了神经细胞损害,从而加速了AD小鼠的痴呆进程。因此,临床上要加强对AD患者病原菌感染的预防和重视,降低患者合并感染的机会,延缓疾病进展。