miR-210通过NF-κB信号通路对胃癌细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移的影响*

魏明乔, 赵丽楠, 吴一辰, 王拓, 李树敏

(赤峰学院附属医院 检验科, 内蒙古 赤峰 024000)

胃癌是全球范围内发病率和病死率均较高的疾病,目前临床中对胃癌患者的治疗主要为手术联合放化疗和药物治疗,但因胃癌患者早期并无明显症状,多数患者确诊时已经为中晚期,因此临床治疗的总体预后较差,总体生存率也较低[1-2]。近年来随着分子生物学的不断发展,寻找有效信号通路干预已经成为临床治疗胃癌的热点,以期能为今后胃癌防治提供新方向[3]。核转录因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)是一种特定多效转录因子,已有研究指出NF-κB信号通路激活可造成下游效应因子转录,促进细胞增殖和血管形成,参与到机体炎性反应中,促进胃癌的发生发展[4-5]。已经明确NF-κB在多数肿瘤中为活化状态,可促进肿瘤的发生和进展,也能够在一定程度上发挥抗肿瘤作用,因此临床中调整NF-κB信号通路有望成为临床防治胃癌的有效方法[6]。微小RNA(microRNA,miRNA)为长度18～22个核苷酸的内源性非编码RNA,其可与相关靶mRNA相互作用,进而影响mRNA的转录过程以调节相关基因表达[7]。近年来已有研究指出miRNA在细胞增殖、侵袭、转移、凋亡及存活中均有重要作用,如miR-210对结肠直肠癌、膀胱癌、乳腺癌等均有促进作用,且该过程与NF-κB信号通路密切相关[8]。但临床中尚未明确miR-210在MGC803胃癌细胞中的表达情况,因此本研究分析了miR-210通过NF-κB信号通路参与胃癌发生发展的免疫调控作用,以期能为今后临床治疗提供指导。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株 由北京协和细胞资源中心购入MGC803胃癌细胞以及正常的胃黏膜上皮细胞。

1.1.2主要仪器及试剂 胎牛血清(美国Gibco公司);青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司);miR-210 inhibitor及inhibitor control(上海皓元生物医药科技有限公司);Trizol试剂和Lipofectamine 2000试剂(赛默飞世尔科技有限公司);CKK-8(日本同仁公司);Transwell小室(美国Coring公司);荧光定量聚合酶链式反应(PCR)测定试剂盒、逆转录试剂盒和AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡测定试剂盒(日本TaKaRa公司);电化学发光(ECL)试剂(碧云天生物科技研究所);IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB抗体(美国CST公司)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞培养和转染[7]胃黏膜上皮细胞采用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每周2～3次更换新鲜培养基,在密度达到80%时传代后使用。将MGC803胃癌细胞置入含有10%胎牛血清的改良Eagle培养基(dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco,DMEM)培养基内培养,分别加入100 mg/L链霉素和1×105U/L青霉素,然后放置在含有5%CO2的37 ℃、95%相对湿度培养箱内培养,直至细胞贴壁生长密度超过80%时,加入0.25%胰蛋白酶进行消化传代。将对数生长期的MGC803胃癌细胞在6孔板上接种,每孔接种2×105个细胞,置入培养箱内常规培养,当细胞达到50%融合时,依据Lipofectamine 2000试剂说明书转染miR-210 inhibitor及miR-210 inhibitor control,并将细胞分为空白对照组、阴性对照组(miR-210 inhibitor control)及实验组(miR-210 inhibitor),将各组细胞置入37 ℃培养箱内继续培养72 h。

1.2.2qRT-PCR检测miR-210表达[7]Trizol法提取对数生长期的MGC803胃癌细胞中总RNA,使用逆转录试剂盒合成cDNA,以其为模板,行荧光定量PCR试剂盒扩增,条件为:94 ℃预变性3 min,94 ℃ 15 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s,共40个循环。使用定量2-ΔΔCt法计算miR-210相对表达水平。

1.2.3CCK-8实验检测细胞增殖[7]将转染后MGC803胃癌细胞接种至96孔板内,每孔接种5×103个细胞,设置3个复孔,细胞贴壁生长后,分别在24、48及72 h时每孔内均缓慢加入CCK-8溶液10 μL,置入37 ℃培养箱内孵育4 h,使用酶标仪测定450 nm波长处的OD值,重复3次,绘制生长曲线。

1.2.4Transwell实验检测细胞侵袭[7]各组细胞转染后的MGC803胃癌细胞均加入0.25%胰蛋白酶消化,使用Eagle培养基培养液悬浮和调整细胞浓度为1×108个/L。Transwell小室的上室内加入100 μL细胞悬液,下室内加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液500 μL,置入37 ℃培养箱内培养48 h。取出Transwell小室,0.1%结晶紫染色20 min、PBS洗涤、风干后随机选取5个视野观察记录,重复3次。

1.2.5划痕实验检测细胞迁移 将转染后的MGC803胃癌细胞接种至6孔板内,每孔接种1×106个细胞,置入37 ℃培养箱内培养细胞至贴壁单层生长,使用无菌移液枪对6孔板表面做垂直直线划痕,PBS洗涤后更换培养液,培养48 h,均设置3个复孔,使用显微镜观察细胞迁移个数,重复3次。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡 将转染后培养72 h的MGC803胃癌细胞使用预冷PBS洗涤2次,离心收集1×106个细胞,加入100 μL结合缓冲液重悬细胞,然后加入5 μL的FITC-Annexin V溶液孵育15 min,再加入5 μL的PI染液,混匀避光反应15 min,使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,重复3次。

1.2.7Western blot检测IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB水平 取对数生长期MGC803胃癌细胞的蛋白,加入适量RIPA裂解液于冰上裂解30 min,置于4 ℃下12 000r/min离心30 min,取上清液,加入等量总蛋白上样,以10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白分离后电转至PVDF膜上,置入含5%脱脂奶粉的封闭液内封阻1 h,分别加入一抗(1∶500)后置于4 ℃下过夜杂交,PBST洗涤3次,10 min/次,然后加入HRP标记的二抗(1∶2 000),室温下杂交2 h,PBST洗涤3次,10 min/次,加ECL试剂显影,以β-actin作为内参照,使用Image J软件分析蛋白表达情况,重复3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 正常胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞中miR-210表达水平

与正常胃黏膜上皮细胞相比,MGC803胃癌细胞中miR-210水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：(1)与正常胃黏膜上皮细胞比,P<0.05。

2.2 各组miR-210转染效率

与空白对照组、阴性对照组细胞相比,实验组细胞中miR-210表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：(1)与空白对照组比,P<0.05;(2)与阴性对照组相比,P<0.05。

2.3 各组细胞增殖能力的比较

与空白对照组、阴性对照组相比,实验组细胞的增殖能力降低,差异有统计学意义(P<0.05),空白对照组和阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。 见图3。

注：(1)与空白对照组比,P<0.05;(2)与阴性对照组比,P<0.05。

2.4 各组细胞侵袭能力的比较

与空白对照组、阴性对照组相比,实验组转染后48 h的细胞侵袭个数减少,差异有统计学意义(P<0.05 ),空白对照组和阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见图4和表1。

表1 各组细胞侵袭能力的比较Tab.1 Comparison of cell invasion ability among three groups

图4 各组细胞侵袭侵袭能力(Tranwell,×100)Fig.4 Comparison of cell invasion ability among three groups(Tranwell,×100)

2.5 各组细胞迁移情况比较

与空白对照组、阴性对照组相比,实验组划痕的距离变化明显,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5和表2。

表2 各组细胞迁移情况的比较Tab.2 Comparison of cell migration among three groups

图5 各组细胞划痕试验结果Fig.5 Result of cell scratch assay in three groups

2.6 各组细胞凋亡情况比较

与空白对照组、阴性对照组相比,实验组细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05),空白对照组和阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见图6和表3。

表3 各组细胞凋亡能力的比较Tab.3 Comparison of apoptosis ability in each group

图6 各组细胞凋亡能力的比较Fig.6 Comparison of apoptosis ability among three groups

2.7 各组细胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平的比较

如图7,与空白对照组、阴性对照组相比,实验组细胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平均降低,差异具有统计学意义(P<0.05),空白对照组和阴性对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。

注：A为蛋白表达条带图,B为蛋白表达水平;(1)与空白对照组比,P<0.05;(2)与阴性对照组比,P<0.05。

3 讨论

近年来虽然对胃癌患者的诊断、手术治疗和靶向治疗等方面均有明显进展,但由于胃癌的发病分子机制尚不明确,因此虽然部分患者可获得及时合理的治疗,仍然无法获得较佳的预后[9]。有研究指出[10],miRNA表达异常对肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移均有一定作用,因此深入探究miRNA的生物学功能对恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗具有积极意义。既往有研究表明[11],人类多种肿瘤内miR-210均呈现高表达,其能够靶向调控基因表达或信号通路活化,是临床已经明确的致癌基因之一。Liu等[12]在研究中指出,骨肉瘤组织中miR-210表达明显高于正常组织,且miR-210可促进骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。Luan等[13]也指出,前列腺组织中miR-210表达水平高于癌旁组织,其可通过下调BNIP3表达而抑制前列腺癌细胞凋亡。同时临床中也有文献指出miR-210的高表达与乳腺癌、肾癌、多发性骨髓瘤等肿瘤淋巴结转移、TNM分期、不良预后等均存在相关性[14-15]。因此积极明确miR-210在胃癌发生发展中的作用,对改善患者预后有重要意义。

miRNA可对基因内源性非编码RNA进行调控,且miRNA在肿瘤的发病机理中有重要作用,miRNA表达谱可作为临床诊断、预后、疾病管理的潜在生物标志[16]。因此本研究中下调miR-210后细胞增殖能力降低,细胞迁移、侵袭率降低,而细胞凋亡率升高,同时细胞内p-IκBα、p-NF-κB水平均降低,提示p-IκBα、p-NF-κB水平均降低,提示miR-210可能通过激活NF-κB信号通路而调控了某些相关蛋白表达,进而促进了细胞凋亡。本研究结果与既往研究一致,抑制NF-κB信号通路可抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移,进而促进细胞凋亡[17]。由于NF-κB可以IκB相结合形成复合体,进而在细胞质内以无活性形式存在,因此当细胞遭受外界刺激后,IκB发生磷酸化而暴露NF-κB核定位位点,进而转移至细胞核内,对相关基因的转录和表达过程进行调控,达到调控细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡的效果[18]。而miR-210作为缺氧特异性microRNA,无论是在病理性还是生理性的低氧环境下,其均会呈现高表达。因此当胃癌患者发病后体内miR-210表达也会升高,此时miR-210可通过靶向基因SDHD激活低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF-1),而HIF-1激活上调后又会促进miR-210表达变化,进而影响肿瘤血管生成过程,这种作用形成恶性循环[19]。

综上所述,MGC803胃癌细胞内miR-210水平明显升高,下调miR-210可通过抑制NF-κB信号通路抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移,促进胃癌细胞凋亡。提示通过抑制miR-210表达可形成一个协同或辅助作用因子而影响肿瘤的生长和发展,为开发胃癌抗血管生成药物提供了理论基础。