哮喘儿童ORMDL3基因多态性及基因与环境交互作用的分析*

段朴英, 熊妍 , 蒙文娟, 李波, 杨俊, 吴静, 朱晓萍,***

(1.贵州医科大学附属医院 儿科呼吸, 贵州 贵阳 550004; 2.贵州医科大学 儿科学院, 贵州 贵阳 550025; 3.六枝特区人民医院 儿科, 贵州 六枝 553400)

支气管哮喘(简称哮喘)是一种异质性疾病,其症状及呼气气流受限是可变的[1]。以气道慢性炎症及高反应性为特征,具有慢性、异质性和波动性特点[2]。多项研究显示血清类黏蛋白1样蛋白3(orosomueo id 1-like protein 3,ORMDL3)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与儿童哮喘患病风险有关,且rs7216389位点SNP与儿童哮喘关联性最强[3-4]。基因与环境的综合作用促进儿童哮喘的发生发展[2]。发生在生命早期的基因环境相互作用尤为重要,可影响成熟的免疫系统[5]。许多危险因素,包括早期致敏、母亲吸烟、早期病毒感染等,已被证明可持续影响肺功能及哮喘的发展[2]。目前,国内对ORMDL3基因与环境交互作用的研究较少。本研究旨在探讨ORMDL3基因SNP与儿童哮喘患病风险及该基因与环境相互作用的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究采用病例对照研究,选取2021年7月—2022年8月就诊的哮喘儿童102例为哮喘组,其中男74例、女28例,0～14岁、平均(4.57±0.22)岁,均符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》的诊断标准[6]。选取同期于儿童保健门诊健康体检的无家族哮喘史及过敏史的儿童54例为对照组,其中男38例、女16例,0～14岁、平均(5.46±0.45)岁。所有入组儿童均无自身免疫性疾病及其他慢性疾病,近4周无上呼吸道感染史、全身糖皮质激素及抗过敏药物史。收集一般资料,湿疹史、家族过敏史、被动吸烟史、分娩及喂养方式等;两组儿童在性别、年龄构成上均差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经贵州医科大学伦理委员会批准(2020伦审第208号),所有研究对象监护人均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1血清特异性IgE检测 选用吸入性及食物性过敏原特异性 IgE 抗体检测试剂盒(国械注进20182402469,A211124AU/A220114AA),采用欧蒙印迹法,操作步骤严格按说明书进行,使用EUROLineScan软件判读结果。吸入性变应原:树组合(柳树/杨树/榆树)、普通豚草、艾蒿、尘螨组合(屋尘螨/粉尘螨)、屋尘、猫毛、狗上皮、蟑螂、霉菌组合(点青霉/分枝孢霉/烟曲霉/交链孢霉)、律草;一种及以上吸入性过敏原阳性判定为特应性阳性,对应的特异性IgE≥0.7 KU/L。

1.2.2ORMDL3基因分型 采用EDTA-K2抗凝管采集入组研究对象外周血2 mL,DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)提取DNA;Primer6设计引物(上海捷瑞生物公司合成),对ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位点分别进行PCR扩增,rs7216389位点上游引物为5′-CCTGCCTCCAAAAC

CTAGCA-3′,下游引物为5′-GCAGTTCTGTCGCTGTTGTT-3′,产物253 bp;rs12603332位点上游引物为5′-GCTTGAGTGTCTGGCATA-3′,下游引物为5′-CTAGGTCTACAGGAGTTGAG-3′,产物228 bp;PCR反应总体积为20 μL,其中DNA模板5 μL、2×TaqPCR预混试剂Ⅱ 10 μL、上下游引物各0.5 μL,双蒸水4 μL。PCR反应条件均为(94 ℃、3 min预变性,94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35 个循环;最后72 ℃延伸5 min);4 ℃保存。用1.5%琼脂糖凝胶(含GeneRed核酸染料0.1 ml/L)120 V 30 min对PCR产物进行电泳,经凝胶成像仪系统(Syngene G:BOX EF2)处理后保存结果。ABI 3730型基因分析仪对产物进行测序,rs7216389、rs12603332位点测序峰图见图1、图2,箭头所指即为基因型所在位置,单峰为纯合型,套峰为杂合型。

图1 rs7216389位点测序峰Fig.1 Peak pattern of rs7216389 locus

图2 rs12603332位点测序峰Fig.2 Peak pattern of rs12603332 locus

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0软件,计数资料采用n(%)描述,计量资料为非正态分布采用M(P25,P75)描述,采用χ2检验,对比分析组间的计数指标差异情况;Mann-WhitneyU检验分析组间非正态指标差异;采用logistic回归分析ORMDL3基因与儿童哮喘患病风险的关系,Haploview软件进行连锁不平衡及单倍型分析,D为连锁不平衡系数,D>0.8 为强连锁不平衡,广义多因子降维法(generalized multifactor dimensionality reduction,GMDR)进行ORMDL3基因-环境的交互分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本的Hardy-Weinberg平衡检验

对rs7216389、rs12603332在两组的分布进行Hardy-Weinberg平衡检验,显示符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),说明本次抽样具有群体代表性。rs7216389位点对照组(P=0.084)、哮喘组(P=0.230),rs12603332位点对照组(P=0.084)、哮喘组(P=0.580)。

2.2 ORMDL3基因多态性与儿童哮喘易感性的分析

rs7216389位点等位基因频率在两组间的分布比较,差异无统计学意义(P>0.05);哮喘组TT基因型频率高于对照组,TC基因型频率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);以CC基因型作为参照,携带TT、TC基因型的儿童患哮喘的风险分别是携带CC基因型的7.000倍(95%CI为1.372～35.711)、8.312倍(95%CI为1.555～44.446),差异有统计学意义(P<0.05);rs12603332等位基因、基因型频率在两组间分布比较,差异无统计学意义(P>0.05);以AA作为参照,携带AG基因型儿童哮喘患病风险为AA基因型儿童的4.266(95%CI为1.096～16.608),差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 ORMDL3基因两位点基因型、等位基因比较及患病风险[n(%)]Tab.1 Comparison of genotypes and alleles at two locus of ORMDL3 gene and risk to disease[n(%)]

2.3 ORMDL3基因两位点连锁不平衡及单倍型

ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位点D为1,r2为0.91,两位点间为强连锁不平衡(图3)。TG、CA 、TA 3种单倍型在组间分布比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位点单倍型频率比较Tab.2 Comparison of haplotype frequencies at rs7216389 and rs12603332 of ORMDL3 gene

图3 连锁不平衡热图Fig.3 Linkage disequilibrium plot

2.4 ORMDL3基因两位点间的交互作用分析

应用GMDR分析rs7216389、rs12603332位点间的交互作用,结果显示rs7216389、rs12603332位点交叉一致性为100%,为最佳模型,两位点间显著性检验差异有统计学意义(P<0.05),表明rs7216389、rs12603332间交互作用较强,这种交互对儿童哮喘发病风险可能具有重要影响。见表3。

表3 ORMDL3基因两位点间的交互作用GMDR分析结果Tab.3 MDR analysis results of ORMDL3 gene interaction between two loci

2.5 ORMDL3基因与环境交互作用分析

采用GMDR分析rs7216389位点与特应性、湿疹史、家族过敏史、母乳喂养、被动吸烟、剖宫产分娩的交互作用,其中三、四、五及七阶模型交叉一致性均为10/10,但七阶模型检验样本准确性(0.882)低于三、四、五阶模型(0.946),故选三、四、五阶模型为最佳模型,且其交互作用差异有统计学意义(P<0.05)。而基于GMDR树形图中,rs7216389位点、湿疹史、家族过敏史、特应性都分布在同一主树杈上,有较强的交互作用,因此最佳模型为4因子模型。见图4、表4。

表4 ORMDL3基因rs7216389位点与环境交互作用GMDR分析结果Tab.4 GMDR analysis results of ORMDL3 gene rs7216389 locus interacting with environment

图4 rs7216389与环境交互GMDR树形图Fig.4 GMDR dendrogram of rs7216389 interacting with the environment

3 讨论

哮喘的发病率逐年增加,造成了巨大的疾病负担[7]。哮喘控制不佳是一个公共卫生问题,也是儿童缺课或住院的主要原因[8]。因此对儿童哮喘规范诊治以减轻疾病负担尤为重要[9]。哮喘是遗传和环境综合作用下的异质性疾病,基因是致敏倾向的基础,而暴露于危险因素可能会改变哮喘的严重程度[10]。既往研究报道了多种危险因素与儿童哮喘之间的关联,但本质上观察性研究因果关系很难得到证实[11]。ORMDL3位于染色体17q21上,已有较多研究证实了ORMDL3基因SNP与儿童哮喘易感性有关,ORMDL3 基因某些位点的SNP使ORMDL3的转录表达增加,同时与哮喘相关的细胞因子变化有关[4]。研究发现ORMDL3主要调控内质网应激、胞内Ca2+平衡、激活未折叠蛋白反应,参与自噬、凋亡等[12]。

本研究中哮喘组ORMDL3基因rs7216389的TT、TC基因型频率高于对照组(P<0.05),两组间等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。logistic回归分析显示TT和TC基因型儿童哮喘患病风险分别为CC基因型儿童的7.000、8.312倍;表明ORMDL3基因rs7216389位点的SNP与儿童患哮喘风险相关,rs7216389位点TT、TC基因型是儿童患哮喘的风险因子,与之前的研究一致[13-14],但与阳爱梅等[15]研究不一致,考虑与遗传背景不同有关。虽然rs12603332等位基因、基因型频率在两组间分布差异均无统计学意义(P>0.05),但logistic回归分析显示AG基因型儿童哮喘患病风险为AA基因型的4.266倍(P<0.05),表明rs12603332位点AG基因型是儿童哮喘患病的风险因子。其等位基因、基因型频率在两组间分布差异无统计学意义,考虑与本研究样本量偏小有关,增加样本量可能提供更准确的结果,表明rs12603332位点的SNP可能与儿童哮喘易感性有关,这与Afzal等[16]研究rs12603332多态性与巴基斯坦人群哮喘易感性有关的结果一致,而与Zeinaly[17]等人在伊朗西北部阿塞拜疆人的研究结果不一致,可能的原因为不同地域其遗传背景不同有关。

连锁不平衡即在一条染色体中,存在着不同基因位点的等位基因的机会,是一个群体遗传力量的敏感指标[18]。连锁不平衡在17q基因座的 SNP 之间是非常强的[19],本研究中rs7216389与rs12603332的连锁不平衡D′为1,显示强连锁不平衡,这种连锁不平衡结构导致变异之间的高度相关性,但由于本研究样本量偏小,可能造成连锁不平衡被高估。单倍型即单条染色体上共存的一系列遗传变异位点的组合[20],单倍体等位基因可能与因果变异连锁不平衡更近,单倍型本身可能是具有重要意义的因果变异[21],本研究中TG、CA、TA 3种单倍型在两组间分布差异无统计学意义(P>0.05),提示这3种单倍型可能与儿童哮喘易感性无关联。基因与环境的交互可增加哮喘的患病风险[22]。对过敏原敏感的17%的儿童在8岁时患哮喘的风险比未致敏的人高12倍[23]。然而有研究显示不管致敏状态如何,出生时接触变应性致敏与哮喘风险降低有关[24]。表明单一危险因素不足以导致哮喘,需要其他危险因素综合作用。染色体17q21上的遗传性多态现象被发现可以预测儿童期发作的哮喘,并且早期暴露于间接吸烟的风险进一步增加[3]。本研究中rs7216389、rs12603332两位点存在交互作用,提示两位点交互对儿童哮喘患病风险可能有重要影响。rs7216389与湿疹史、家族过敏史、特应性的交互作用有统计学意义,提示该位点与湿疹史、家族过敏史、特应性交互可能是儿童哮喘患病的风险因素。我们推测rs7216389位点TT或者TC基因型的易感儿童,有湿疹史、家族过敏史和(或)吸入性过敏原阳性者,患哮喘的风险可能会增加。王冰洁[25]的研究结果表明ORMDL3基因rs12603332位点与哮喘家族史、呼吸道病毒感染史极易共同增加广东儿童患哮喘的风险。环境在调节遗传效应中起着重要作用[26],有研究分别表明哮喘相关基因丝聚蛋白(filaggrin,FLG)与母乳喂养、变应原接触、宠物接触及城市居住地有交互作用,腺苷酸环化酶9(adenglyl cyclase IX,ADCY9)与变应原接触有交互作用[27-28]。

综上,儿童哮喘是一种多基因遗传性疾病,其基因-环境交互作用在儿童哮喘的发生发展中发挥重要作用。基因多态性及基因-基因、基因-环境的交互分析可为儿童哮喘的早期预测、干预提供依据。