咖啡因对大鼠成骨细胞活性及DNA甲基化水平的影响*

黄徐, 陈永福, 杨晶晶, 尹从玉, 潘雪莉*

(贵州医科大学 公共卫生与健康学院 &环境污染与疾病监控教育部重点实验室, 贵州 贵阳 550025)

咖啡因是一种植物生物碱,常见来源包括咖啡、茶、可乐果及可可豆等[1],是一种中枢神经系统的兴奋剂,具有减轻疲劳、提神醒脑的功效。中国是世界上咖啡新兴消费国之一,消费量年增长率超过20%,因此咖啡因对健康的影响也受到越来越多的关注[2-5]。有研究报道过量摄入咖啡因,会增加髋部骨折和骨质疏松症的患病风险[6]。骨代谢终身都在进行,需一系列细胞的参与,主要包括成骨细胞和破骨细胞[7]。成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞,能够特异性分泌多种生物活性物质,促进骨基质形成和骨组织的矿化[8]。研究表明不同剂量的咖啡因会对成骨细胞活力产生不同的影响[9],但具体机制研究较少。DNA甲基化是以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,使胞嘧啶5位碳原子甲基化为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)的过程[10]。DNA甲基化受DNA甲基转移酶(DNA methytransferase,DNMTs)和甲基胞嘧啶双加氧酶(tet methylcytosine dioxygenase ,TETs)的调控,DNMT1主要参与DNA甲基化模式的维持,而TET2作为调控DNA去甲基化的关键酶负责5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl cytosine,5-hmC)[11]。研究发现,DNA甲基化参与成骨细胞生长、成熟和分化[12-13]。有研究报道,小鼠产前摄入咖啡因增加了胎儿肾上腺组织中类固醇生成因子1的甲基化水平,出现不利于小鼠骨骼生长的情况[14];高剂量咖啡因暴露也与人类骨髓间充质干细胞中DNA甲基化的降低存在相关性[15];但咖啡因对成骨细胞整体DNA甲基化和去甲基化的影响未见报道。为此,本研究以大鼠原代成骨细胞作为研究对象,检测不同浓度咖啡因处理后大鼠成骨细胞活性,观察DNMT1及TET2蛋白表达、5-mC及5-hmC含量,观察咖啡因对大鼠成骨细胞整体DNA甲基化和羟甲基化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1动物及细胞来源 无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级健康SD大鼠,购自长沙市天勤生物技术有限公司,动物合格证编号[SCXK(湘)2019-0014];SD大鼠交配获得新生72 h内乳鼠,取乳鼠颅盖骨提取原代成骨细胞。本实验经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准(批准号N2200376),实验操作符合贵州医科大学实验动物伦理学要求。

1.1.2主要试剂与仪器 咖啡因(上海融禾医药科技有限公司),DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶/EDTA消化液(美国Gibco公司),CCK-8细胞增殖试剂盒(大连美仑技术有限公司),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色试剂盒、茜素红染色液(北京索莱宝科技有限公司),DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司),ELISA试剂盒(上海雅吉生物科技有限公司),Anti-DNMT1 Rabbit pAb(武汉菲恩生物科技有限公司),Anti-TET2 Rabbit pAb(江苏亲科生物研究中心有限公司),Goat anti-Rabbit IgG(武汉三鹰生物技术有限公司);超净工作台(苏州亿达净化钢结构工程有限公司),超级酶标仪(美国Thermo Fisher公司),PowerPacTMBasic电泳仪、Mini-Protean Tetra小型垂直电泳槽、Mini Trans-Blot转印(湿转)槽、凝胶成像系统ChemiDocTMARS+(美国Bio-Rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1细胞提取及培养 将新出生72 h内的SD大鼠在深麻状态下颈椎脱臼处死,无菌操作分离出SD大鼠的颅盖骨,剔除组织,用1×PBS反复冲洗颅盖骨至白色,将颅盖骨剪成小骨片;在小骨片中加入0.25%胰蛋白酶液37 ℃消化30 min、1×PBS洗涤、加入Ⅱ型胶原酶液37 ℃消化3 h,消化液用筛网(70 μm)过滤、收集上清液、离心后弃上清液、1×PBS洗涤沉淀,采用含10% FBS DMEM培养基重悬细胞并计数;计数后以1×105个/mL的细胞密度接种于6 cm培养皿中,置于37 ℃、5%CO2培养箱内进行细胞培养,待细胞生长至80%左右进行细胞传代,并采用差异贴壁法纯化成骨细胞;采用第3代成骨细胞进行实验。

1.2.2大鼠成骨细胞的鉴定 取大鼠第3代成骨细胞以2.5×104个/mL接种于12孔板中,倒置显微镜观察成骨细胞形态和生长情况,定期拍照记录;培养3 d后,采用改良钙钴法对成骨细胞进行ALP染色,待细胞生长至90%左右吸去培养液,1×PBS冲洗、丙酮(4 ℃预冷)固定10 min、1×PBS清洗,加入ALP孵化液37 ℃孵化1 h、加入2%硝酸钴孵化5 min、1%硫化胺孵化1 min、无水乙醇脱水后在显微镜下观察染色结果;采用茜素红法对成骨细胞矿化结节染色,接种24 h细胞贴壁后改换矿化培养液,每2 d进行换液,待细胞生长至90%左右后吸去培养液,无菌蒸馏水冲洗细胞、无水乙醇固定20 min、无菌蒸馏水清洗后,加入0.1%茜素红染液37 ℃孵育30 min、无菌蒸馏水冲洗、晾干,显微镜观察矿化结节的染色结果。

1.2.3分组与成骨细胞代谢活力 取第3代成骨细胞以1×104个/mL接种于96孔培养板中,37 ℃、5%CO2培养箱中贴壁培养48 h;本研究剂量设计参考文献[16],采用0.00、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00及4.00 mmol/L咖啡因分别作用24 h及48 h,通过CCK-8实验,筛出0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmo/L咖啡因处理48 h后成骨细胞代谢活力强,最后确定0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L咖啡因分别处理成骨细胞48 h后得到本次实验的5个组。按照CCK-8试剂盒说明书检测细胞代谢活力,酶标仪检测在450 nm处的吸光度(OD)值,结果计算公式为:细胞活力(%)=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.4ALP活力和骨钙素(bone clearing calcium,BGP)含量 取第3代成骨细胞以2.5×104个/mL接种于12孔板中,37 ℃、5%CO2培养箱中贴壁培养48 h,用0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L咖啡因处理成骨细胞48 h,收集细胞培养液,离心后取上清,按ALP活性测定试剂盒说明书检测成骨细胞中ALP活力,按BGP的ELISA试剂盒说明书检测成骨细胞中BGP的含量。

1.2.5DNMT1和TET2蛋白表达 取第3代成骨细胞以1×105个/mL接种于6 cm培养皿,37 ℃、5%CO2培养箱中贴壁培养,待细胞密度达50%时,以0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L咖啡因处理成骨细胞48 h;弃培养液、1×PBS清洗细胞3次、弃1×PBS并根据细胞的数量加入蛋白裂解液(RIPA∶蛋白酶抑制剂=100∶1)冰上裂解1 h,收集细胞裂解液于EP管中,15 000 r/min离心15 min;BCA蛋白定量试剂盒检测上清液中蛋白的浓度,加入5×Loading Buffer缓冲液,100 ℃煮沸蛋白10 min变性蛋白,将蛋白样本加至8%SDS-PAGE凝胶中,60 V电泳30 min,调整电压为120 V电泳1 h,切下目标蛋白TET2和DNMT1所在部位的凝胶,冰上300 mA恒流分别转膜 90 min(TET2)和180 min(DNMT1),5%脱脂奶粉封闭2 h,一抗(DNMT1稀释比例为1∶500、TET2稀释比例为1∶500、β-actin稀释比例为1∶2 000)4 ℃孵育过夜,二抗室温孵育2 h(兔抗比例为1∶10 000),ECL显影,使用多功能成像仪曝光、采图,使用Image J软件进行半定量分析,重复3次。

1.2.65-mC和5-hmC水平 取第3代成骨细胞以1×105个/mL接种于6 cm培养皿,置于37 ℃、5%CO2培养箱中贴壁培养48 h,以0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L咖啡因处理成骨细胞48 h,收集成骨细胞,DNA提取试剂盒提取成骨细胞DNA,按5-mC和5-hmC的ELISA试剂盒说明书检测成骨细胞DNA中5-mC和5-hmC水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠成骨细胞鉴定

倒置显微镜下观察可见未染色的大鼠成骨细胞充分伸展,呈梭形、三角形或不规则多边形;ALP染色结果显示成骨细胞呈现多边形并有长突起,成骨细胞胞膜及胞浆内颗粒染色呈紫黑色;茜素红染色结果显示成骨细胞有大量矿化结节,钙结节被染成橘红色。见图1。

2.2 成骨细胞代谢活力

CCK-8结果如表1所示:与0.00 mmol/L组比较,0.25、0.50 mmol/L咖啡因组大鼠的成骨细胞代谢活力增加,1.00、2.00 mmol/L咖啡因组大鼠的成骨细胞代谢活力降低,差异均有统计学意义(P<0.05),提示低浓度咖啡因促进成骨细胞代谢活力,高浓度咖啡抑制成骨细胞代谢活力,随剂量的增加对细胞代谢活力的抑制逐渐增强。

表1 不同剂量咖啡因对大鼠成骨细胞代谢活力的影响Tab.1 Effect of different doses of caffeine on the metabolic viability of rat osteoblasts

2.3 成骨细胞ALP活性及BGP含量

结果如表2所示:与0.00 mmol/L组比较,0.50 mmol/L咖啡因组大鼠的成骨细胞中ALP活性和BGP含量升高;2.00 mmol/L咖啡因组大鼠的成骨细胞中ALP活性及BGP含量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示低浓度咖啡因促进成骨细胞骨标志物的表达,高浓度咖啡抑制成骨细胞骨标志物的表达。

表2 不同剂量咖啡因对大鼠成骨细胞ALP活性及BGP含量的影响Tab.2 Effect of different doses of caffeine on ALP activity and BGP content in rat

2.4 成骨细胞DNMT1、TET2 蛋白表达

Western blot结果显示:与0.00 mmol/L组比较,0.50 mmol/L咖啡因组大鼠的成骨细胞中DNMT1蛋白表达降低,TET2蛋白表达增加(P<0.05);2.00 mmol/L咖啡因组大鼠的成骨细胞中DNMT1蛋白表达增加,TET2蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示低浓度咖啡因抑制大鼠成骨细胞DNMT1蛋白表达,促进TET2蛋白表达,高浓度咖啡因促进大鼠成骨细胞DNMT1蛋白表达,抑制TET2蛋白表达。见图2。

注：A为蛋白条带图,B为蛋白表达水平;与0.00 mmol/L组比较,(1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.5 成骨细胞5-mC及5-hmC含量

ELISA结果如表3所示:与0.00 mmol/L组比较,0.25、0.50 mmol/L咖啡因组大鼠成骨细胞中5-mC含量降低,5-hmC增加,差异均有统计学意义(P<0.05);1.00、2.00 mmol/L咖啡因组大鼠成骨细胞中5-mC增加,5-hmC降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。提示低剂量咖啡因降低大鼠成骨细胞中整体DNA甲基化水平,增加整体DNA羟甲基化水平;高剂量咖啡因增加大鼠成骨细胞中整体DNA甲基化水平,降低整体DNA羟甲基化水平。

表3 不同剂量咖啡因对大鼠成骨细胞5-mC及5-hmC水平的影响Tab.3 Effect of different doses of caffeine on 5-mC and 5-hmC levels in rat

3 讨论

现代生活中,咖啡因作为一种常见的神经兴奋剂,已被广泛应用于各个领域,咖啡因与健康的关系密不可分。研究表明,长期大量摄入咖啡因可能对骨的发育和健康产生负面影响[17]。动物实验证明低剂量咖啡因加快骨转化,成骨细胞活跃,促进骨代谢;高剂量咖啡因抑制成骨过程,抑制骨代谢[18]。细胞实验同样显示,低剂量的咖啡因可促进成骨细胞的增殖,高剂量的咖啡因则抑制成骨细胞增殖甚至加快成骨细胞的凋亡[19]。本研究发现低剂量咖啡因处理成骨细胞48 h后,成骨细胞代谢活力增强;高剂量咖啡因处理成骨细胞48 h后,成骨细胞代谢活力降低,且随剂量的增加对细胞代谢活力的抑制逐渐增强。这表明,高剂量的咖啡因可以抑制大鼠成骨细胞的代谢活力,可能影响骨的生长和发育。

ALP是成骨细胞主要功能活性酶,与骨组织的新陈代谢密切相关,是成骨细胞重要的标志物之一。在骨组织新生阶段,ALP能促进成骨细胞产生和分泌蛋白质,这些蛋白质沉积在骨基质内,增强其结构和稳定性。不同浓度咖啡因处理成骨细胞48 h后,低剂量的咖啡因升高成骨细胞ALP活性和BGP含量;高剂量的咖啡因降低成骨细胞ALP活性和BGP含量。Su等[20]研究发现在咖啡因刺激下,成骨细胞中ALP和骨保护素表达异常,低剂量咖啡因对成骨细胞活力和ALP活性影响不明显,高剂量咖啡因可导致成骨细胞活力降低甚至凋亡,可抑制成骨细胞分化、骨矿化和细胞外基质的形成。这一结果与我们的研究结果一致。

DNA 甲基化和羟甲基化为目前表观遗传学的重要组成部分,哺乳动物DNA甲基化转移酶包含DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L,其中DNMT1是DNMTs中最重要、目前研究最多的一种,主要参与基因组DNA甲基化模式的维持,被称作维持甲基化酶[21-22]。DNA去甲基化是整体DNA甲基化动态平衡的重要部分,在DNA主动去甲基化过程中,去甲基化酶TET蛋白占据核心地位,TET蛋白有3种亚型,分别为TET1, TET2和TET3,其中TET2是骨生成的启动子,直接影响成骨相关基因5-hmC的水平[23-25]。DNA甲基化的动态平衡受到DNA甲基化和去甲基化的影响,进一步检测不同浓度咖啡因处理大鼠成骨细胞后DNMT1和TET2蛋白的表达及5-mC和5-hmC含量的变化,低剂量咖啡因暴露的大鼠成骨细胞中DNMT1蛋白表达和5-mC含量降低,TET2蛋白表达和5-hmC含量增加;高剂量咖啡因暴露的成骨细胞中DNMT1蛋白表达和5-mC含量增加,TET2蛋白表达和5-hmC含量降低。上述结果显示低剂量咖啡因可降低成骨细胞整体DNA甲基化水平,增加了整体DNA羟甲基化水平;高剂量咖啡因可增加成骨细胞整体DNA甲基化水平,降低了整体DNA羟甲基化水平。有研究报道,骨组织Runt相关转录因子2基因的高甲基化与骨质疏松的发生发展有关[26],我们推测高剂量咖啡因增加整体DNA甲基化水平可能与咖啡因增加骨质疏松患病风险有关,有待于后续深入研究。

综上,本研究发现低剂量咖啡因促进成骨细胞代谢活力,促进DNA羟甲基化降低整体DNA甲基化水平;高剂量咖啡因抑制成骨细胞代谢活力,抑制DNA羟甲基化增加整体DNA甲基化水平。该研究结果为识别咖啡因对骨组织的危害、以及科学饮用咖啡因相关饮料提供了科学依据。