噬菌体药物开发及质控研究进展

杨蓉，赵晨，李端华，饶峻，王辂

(成都大学药学院，成都 610106)

自1915年Frederick Twort发现噬菌体[1]，1917年D'Herelle发现并命名其为“Bacteriophage”[2]以来，噬菌体就被研究用于治疗各种细菌引起的感染性疾病。特别是1923年后，欧洲的格鲁吉亚Eliava噬菌体、微生物学和病毒学研究所和弗罗茨瓦夫(波兰)的Hirszfeld研究所通过噬菌体成功治疗了许多病原菌引起的感染。尽管20世纪中叶由于抗生素的发现并大量运用使得噬菌体治疗的发展受阻，但科学家对噬菌体治疗的研究从未停止。也正是由于抗生素的大规模生产及使用，催生出了大量耐药性细菌，并最终导致多重耐药菌甚至超级耐药菌ESKAPE(屎肠球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌和肠杆菌属)的出现[3]。这时，噬菌体又重新引起了科学家们的兴趣。

然而，D'Herelle时期制定的相关噬菌体治疗法规由于受到现代药物立法的阻碍已经不再适用，这也影响了噬菌体临床试验的开展及相关专利的申请。尽管目前尚无完善的噬菌体相关法规颁布，但在西方国家针对患者的个性化噬菌体治疗已被用于同情用药[4-6][按照美国食品药品监督管理局(FDA)的定义，同情用药指对于患有严重或危及生命疾病的患者，在不能通过现有药品或入选临床试验来得到有效治疗时，可以申请在临床试验之外使用末经上市许可的试验用药物]，在美国和欧洲一些国家已经有噬菌体治疗的相关专利被授权[7-9]，并且可在欧洲某些国家的授权药店购买到人用噬菌体药物，这些现象都展现了噬菌体具有良好的应用前景。

在我国，药物制剂需按《药品生产质量管理规范》(Good manufacturing practice, GMP)进行制备，但目前我国尚无完善的噬菌体药物监管法规，多数噬菌体治疗还仅限于动物治疗。噬菌体具有生物制品的相关特征，因此在制备噬菌体用于研究时可参考我国有关生物制品制定的标准。基于以上描述，本文尝试结合我国现行药典关于生物制品生产、制备及质量控制要求和欧洲药品管理局(European medicines agency,EMA)近年来对噬菌体治疗药物批准途径(包括对细胞库、噬菌体库的质量控制和噬菌体药品的管制)的探索为参照，着重对噬菌体库构建与控制、噬菌体制备与质控和临床前测试等进行综述分析。

1 噬菌体库

噬菌体库构建是噬菌体治疗研究的基础工作。首先创建噬菌体文库和高浓度储存的噬菌体制剂库，以保证能快速实现噬菌体药物递送。前者主要包含相关噬菌体的基本信息，如基因组信息、分类、生命周期和裂解性能等；后者是以稳定制剂形式存放的高浓度噬菌体药物。

1.1 噬菌体库制备

通常，在噬菌体库构建时，噬菌体扩增所用的宿主菌选择、培养基组成以及合适的培养条件对制备和获得用于治疗的高浓度噬菌体至关重要。在生产制备噬菌体的过程中应尽最大可能降低污染和噬菌体降解，并在基因层面上检查噬菌体，以确定噬菌体基因组中是否具有编码抗生素抗性、溶原性(如整合酶、转座酶)、毒性和毒性决定因子的基因。此外，适当的噬菌体/细菌比例[多重感染复数(Multiple infection complex，MOI)]、噬菌体爆发量和吸附效率对噬菌体生产也起着关键作用。对于治疗用途的噬菌体，应优选吸附率高、爆发量大和潜伏期短的噬菌体，这样有利于缩短噬菌体制备周期并快速达到治疗目的。最关键的是，用于治疗的噬菌体应选择毒性噬菌体(也称裂解性噬菌体)，而非温和噬菌体[10]。因为某些温和噬菌体编码的基因能将它们所感染的细菌转化为致病性更强的菌株[11]；其次，温和噬菌体的存在能在相同或相关噬菌体(具有相同的免疫类型)重复感染时使细菌产生免疫现象；另外，温和噬菌体还能参与细菌间的转导[11]，使细菌DNA从一个宿主转移至另一个宿主，这将可能增加细菌的致病性。

1.2 文库质量控制

噬菌体文库构建时的质量控制对治疗的有效性、安全性及可追溯性具有重要作用。应对包括噬菌体形态、基因组特征信息及活性进行检测。

1.2.1 形态学鉴定

1940年Ruska首次使用电子显微镜(Electron microscope，EM)观察到噬菌体[12]，自此开启了对噬菌体进行形态学分类的研究[13-14]。根据尾部形态，科学家们将噬菌体分为三个科：具有短而不收缩的尾巴(Podoviridae)、具有长而不收缩的尾巴(Siphoviridae)和具有长而可收缩尾巴(Myoviridae)[15]。

如今随着检测技术的发展，国际病毒分类委员会(International committee on taxonomy of viruses，ICTV)对各噬菌体家族进行了汇编(http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp)，使得噬菌体分类得到了扩展，主要包括根据宿主范围、结构、衣壳大小和形状、基因组类型(单链/双链DNA或RNA)、基因组大小和对有机溶剂的耐受能力等进行分类。

1.2.2 基因组特征分析

Hershey等[16]在1952年对大肠埃希菌噬菌体T2的研究结果证明了噬菌体的遗传物质是DNA，而非蛋白质，并经研究表明噬菌体的遗传物质可以是任何一种核酸类型。随后，基因组测序和限制性内切酶消化作为噬菌体分类和治疗过程中的分子工具一直被沿用。随着基因测序所需成本降低，该项技术逐渐成为新噬菌体鉴别的重要依据。基因测序技术在噬菌体上的应用将噬菌体基于形态学分类转变至基于基因和蛋白质之间的关系这种更精确的方式进行分类，为新噬菌体的发现提供了可靠的依据。

基因测序在研究菌株对噬菌体产生抗性方面也提供了很大帮助。如Ishino等[17]和Jansen等[18]在细菌基因组中发现了CRISPR/Cas基因，并证明了这是一种噬菌体抗性机制。此外，噬菌体在感染细菌时具有导致有害或有毒基因在细菌群体中传播的风险[19]，因此在噬菌体用于治疗前应先通过基因测序检测其转导能力。

尽管近年来由于基因测序技术的发展使得噬菌体相关的研究得到许多突破，但关于噬菌体如何识别宿主、如何将有害基因转至宿主细菌以及如何应对宿主细菌产生抗性等问题仍需进行深入探索。

1.2.3 活性检测

为保证噬菌体文库治疗的有效性，活性测定是必不可少的，包括宿主范围和生长周期等[20]。

噬菌体的宿主范围是其能感染宿主菌的分类多样性，与宿主表面受体结构相关，由于细菌间表面受体的差异使得噬菌体具有特异性感染宿主菌的特征，这也是噬菌体宿主范围窄的一个重要原因[21-22]。目前，在作为治疗手段时，通常将具有不同窄宿主范围的噬菌体进行混合，以扩展其应用范围并提高治疗效果[23]。

虽然噬菌体宿主范围窄，但随着技术的发展，已有研究表明可通过对噬菌体进行基因层面的改造来扩展其宿主范围[22]，这为噬菌体的应用提供了重要参考。

而对于其生长周期的测定，一步生长曲线[The one-step growth (OSG) curve]可使噬菌体的生长以数据的形式可视化。噬菌体的OSG曲线最早由Ellis[24]于1939年提出，作为新分离噬菌体活性测定的一部分，用于表征噬菌体的生长周期。噬菌体的生长周期主要包含7个步骤：(1)噬菌体与敏感菌碰撞；(2)噬菌体附着；(3)噬菌体核酸摄入；(4)噬菌体蛋白和核酸合成；(5)噬菌体成熟；(6)子代噬菌体释放期；(7)子代噬菌体在细胞外搜寻细菌进行吸附(扩散期)。

2 噬菌体制备与质量控制

2.1 噬菌体培养

目前已有专门的机构为临床或研究提供大规模且高纯度的噬菌体，如噬菌体技术中心(Center for phage technology, CPT)和第比利斯的Eliava研究所[25]。噬菌体扩增所用宿主菌通常是实验室使用的菌株，但这将导致噬菌体应用范围受到限制，因此在实际用于治疗时，可通过使用更多宿主菌(包括一些临床菌株)来生产制备高浓度噬菌体，并且在生产过程充分探索合适的生产条件，如培养温度、时间、培养基组成、MOI和宿主菌引入密度等，这样才可能实现大规模生产噬菌体制剂的目的。

2.2 噬菌体纯化精制

噬菌体作为一种病毒，只能在细菌细胞内繁殖。因此，制备治疗用噬菌体的一个主要障碍是将噬菌体从细菌粗裂解物(内毒素、肽聚糖、外毒素、鞭毛、核酸等)中分离出来，如果不充分除去这些杂质，将在人体中引发炎症、败血症和感染性休克等严重后果[26-28]。

从粗培养物中获取高纯度噬菌体的传统方法包括离心、过滤、超滤、聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)沉淀，CsCl梯度超速离心和透析[29]。随着技术的进步，科学家们将阴离子交换色谱(Anion exchange chromatography)[30]、体积排除色谱(Size exclusion chromatography，SEC)[31]、脱盐柱(Desalting spin column)[32]、甲基丙烯酸酯整体柱(Methacrylate monolith column)[32]等方法用于噬菌体的纯化，并得到了不错的纯化结果。

然而，单一的纯化方法并不能立即得到高浓度纯噬菌体，因此需根据不同纯化方法的特点进行组合使用。通常将噬菌体从粗裂解物中纯化噬菌体的第一步是运用离心、过滤去除较大杂质(如细胞碎片)，再通过透析、超滤等方法对体系进行浓缩。若宿主菌为革兰阴性菌时，还应考虑去除内毒素或脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的步骤[29]。

2.3 噬菌体质量控制

噬菌体制剂的质量控制在参考我国现行药典关于生物制品生产、制备及质量控制要求和EMA近年来对噬菌体治疗药物批准途径的探索的基础上，还应考虑到噬菌体的保存稳定性及吸附效率。

2.3.1 稳定性

维持噬菌体制剂的稳定性对于实现长期有效的噬菌体给药至关重要。许多科学家将稳定性研究(例如温度、pH值、离子强度、溶剂等)作为噬菌体的基础研究，这些条件对噬菌体的浓度及感染活性等的影响和对生产及保存符合治疗目的噬菌体制剂具有重要意义[33]。

噬菌体的稳定性通常使用双层平板测定噬菌体浓度来表征[34]。但该法耗时且费力，如果浓度变化能用更简单方便，且快速的方法进行检测，那将节约很多时间，为此，许多简化的实验方法如单层琼脂平板测定噬菌斑等被开发并应用于浓度测定。

2.3.2 吸附效率

Bertozzi等[35]认为测定噬菌体对宿主细胞的吸附效率对应用(主要为治疗用途)噬菌体时的有效性具有重要意义。作为治疗用途的噬菌体必须具有高吸附效率才能在施用时快速裂解病原菌达到治疗效果。因此，在表征新噬菌体时应及早验证吸附效率以节省更多的时间和资源。而吸附效率通常又与宿主菌大小、噬菌体颗粒有效半径、噬菌体扩散速率和噬菌体与宿主菌碰撞条件下附着的概率等有关。

3 临床前研究

目前，已建立了几种最常见并且与人类细菌感染相关的动物模型，这些动物模型被用于测试新分离噬菌体及其在体内对抗病原菌的效力[36]。

3.1 动物模型

用于噬菌体治疗研究的动物模型包括无脊椎动物或低等脊椎动物模型：线虫(Caenorhabditis elegans)、果蝇(Drosophilamelanogaster)、蜡蛾(Galleriamellonella)和斑马鱼(Daniorerio)；和高等脊椎动物：鸡(GallusGallus)、兔(Oryctolagus Cuniculas)、仓鼠(Mesocricetusauratus)和小鼠(musculus)模型[37](图1)。

图1 用于细菌感染和噬菌体治疗应用的动物模型[46]

这些动物模型主要用于研究感染铜绿假单胞菌[38-42]、沙门菌[43]、金黄色葡萄球菌[43-44]、洋葱伯克菌[45]、粪肠球菌[40-41]、艰难梭菌[46]、大肠埃希菌[47]和弯曲杆菌[48-49]等细菌后噬菌体治疗的安全性及有效性，为噬菌体治疗的有效性、不良反应的发生和与宿主相互作用等提供支撑。

3.2 给药途径

只有当足够且合适数量的噬菌体到达感染部位并杀死病原菌时，噬菌体治疗才算是成功的[50]。在运用噬菌体进行治疗时，通常还与抗生素联合使用[51]，这样能减少抗生素的施用时间和剂量，缓解抗生素耐药菌的发展和药物对宿主的不良影响(包括破坏微生物群的平衡)。根据感染部位和类型，噬菌体治疗包括：局部、静脉和口服给药途径进行。

局部治疗主要涉及：溃疡、外科伤口或烧伤相关的细菌感染[52]。已有相关报道称噬菌体治疗能有效缓解糖尿病足部溃疡[53-54]，这种治疗方式有效地解决了患者免疫功能受损而不能长期施用抗生素的难题。另外，吸入噬菌体溶液已被证明可在人类[55]和小鼠模型中有效对抗多药耐药的细菌性肺部感染[56]。

静脉注射是治疗菌血症的理想途径。Speck等[57]的研究表明噬菌体治疗是安全有效的，但当噬菌体宿主为革兰阴性菌时应关注宿主菌可能释放内毒素导致强烈的免疫反应和过敏反应。此外，在通过静脉注射噬菌体时，其可能在血液中被免疫细胞清除，Dabrowska[58]的研究证明了这一点。

而口服途径涉及胃肠转运，这一过程可能会导致噬菌体失活，但已有相关研究[38,59]结果证明噬菌体可与食物一起服用并经胃肠道后仍有活性。

为了解决以上可能存在的问题，研究人员通过改变噬菌体给药剂型来实现噬菌体到达感染部位并有效裂解病原菌。包括使用脂质体和转运体实现噬菌体递送[60-62]增强噬菌体活性。

4 展望

越来越多的研究表明噬菌体具有应用于人类感染治疗的潜力，尽管目前为止没有统一的噬菌体制剂监管标准，但在临床试验和同情治疗研究中，它们的使用越来越多。另外，如本文所述，在将噬菌体治疗应用于人类临床之前，应保证噬菌体制剂制备的浓度和纯度，充分了解噬菌体文库中每一株噬菌体的生物学特征，并获得足够多的动物模型研究数据以充分了解噬菌体治疗的有效性、安全性及不良反应，为噬菌体应用于人类病菌感染治疗提供更多的参考依据。

另外，值得注意的是，同为天然生物实体的益生菌早在2002年联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization, FAO/WHO)就颁布了相关标准用于监管生产，那么在研究噬菌体制备时或许也可以适当参考益生菌的生产标准，这样就能往更符合药物制剂生产标准的方向靠近。

考虑到目前抗生素耐药形势的严峻性，噬菌体作为潜在的替代疗法应得到更多重视。在研究噬菌体治疗时，可靠的噬菌体文库是必不可少的，因此，此文库所涉及的文库构建、噬菌体药物制备、安全性及有效性评价都应被充分考虑到。更完善且更系统地研究噬菌体制备过程涉及的各个方面、制备时与宿主菌的相互作用机制、施用时与病原菌的相互作用机制及对人体的影响(包括对原驻微生物组的影响及相互作用的机制)等对噬菌体的应用极其重要。因为只有具有全面有效的研究数据才能为噬菌体治疗的广泛应用提供可能。