芽孢杆菌防控柑橘采后病害的研究进展

刘雪峰 袁项成 向苹苇 马晓丽

摘要  在柑橘生长后期、采摘后运输和贮藏期间烂果现象十分普遍，造成了果实品质的恶化和严重的经济损失。芽孢杆菌具有广谱抗菌活性，已广泛应用于农业生产中。通过对近年来国内外有关芽孢柑橘防控柑橘采后病害的研究报道进行分析。发现芽孢杆菌防控柑橘采后病害的研究主要集中在绿霉病和青霉病，酸腐病和炭疽病方面也有少量报道；拮抗菌种主要包括枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，其他芽孢杆菌种类较少；生防机制主要涉及抗菌物质的产生、对营养物质和空间的竞争以及诱导系统抗性。柑橘采后病害生防芽孢杆菌的资源发掘、作用机制均有待深入研究。

关键词  芽孢杆菌；生物防控；柑橘；采后病害

中图分类号  TS255.3   文献标识码  A   文章编号  0517-6611（2024）07-0010-05

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2024.07.003

Research Progress on Controlling Citrus Postharvest Diseases by Bacillus

LIU Xue feng， YUAN Xiang cheng， XIANG Ping wei et al（Chongqing Three Gorges Academy of Agricultural Sciences， Wanzhou， Chongqing 404155）

Abstract  It is very common for citrus to rot during the late growth period， post harvest transportation and storage period， resulting in the deterioration of fruit quality and serious economic losses. Bacillus has broadspectrum antibacterial activity and has been widely used in agricultural production. The research reports on the prevention and control of citrus postharvest diseases by spore citrus at home and abroad in recent years were analyzed. It was found that the research on controlling citrus postharvest diseases by Bacillus mainly focused on green mold and penicillium， and there were also a few reports on acid rot and anthrax;Antagonistic strains mainly include Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens， and other Bacillus species are less;Biocontrol mechanisms mainly involve the production of antibacterial substances， competition for nutrients and space， and induction of systemic resistance. The resource exploration and action mechanism of Bacillus spp. against citrus postharvest diseases need to be further studied.

Key words  Bacillus;Biological prevention and control;Citrus;Postharvest diseases

柑橘是世界上种植最广泛的果树之一。目前，它已在超过137个国家进行了商业种植，年产量超过1.4亿t［1］。由于采后保鲜、预冷、分级、包装与处理不当，冷链设施不足等因素，我国柑橘采后损失率为20%～30%，而在发达国家则为10%～20%［2］。柑橘采后病害分为非传染性病害和传染性病害，前者主要是由恶劣的环境条件或营养不良等因素导致果实畸形、坏死或腐烂，相对较好防治；后者主要因果实受到病原菌侵染造成，也是导致柑橘采后损失的主要原因［3］，为当前防治重点。传染性病害有很多种，包括指状青霉引起的绿霉病［4］、意大利青霉引起的青霉病［5］、白地霉引起的酸腐病［6］、链格孢引起的黑腐病［7］、柑橘间座壳引起的褐色蒂腐病［8］、褐腐疫霉引起的柑橘褐腐病［9］、黑色蒂腐病菌引起的黑色蒂腐病［10］、炭疽病菌引起的柑橘炭疽病［11］、灰葡萄孢引起的灰霉病［12］等。其中，绿霉病和青霉病是柑橘采后最易发生的病害，柑橘采后90%的腐烂由二者引起［13］，可使柑橘损失率达30%～50%［14］。

迄今为止，化学药剂防治是柑橘采后病害防控中应用最广泛和最有效的技术手段。化学杀菌剂是一种作用机理明确、能够抑制或者杀死病原菌的化学合成物，其具有高效、速效、使用方便、经济效益高等优点。但使用不当可对植物产生药害，引起人畜中毒，杀伤有益微生物，造成环境污染，导 致病原菌产生抗药性等［15］。

生物防治是植物采后病害防控的另一条途径。生防菌剂被认为是最有希望替代化学药剂的产品之一［16］。在柑橘生产中，生防菌如芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌、链霉菌被认为是防控柑橘病害的重要工具［17-19］。芽孢杆菌是植物根际和叶际的天然生物，其可以形成内孢子并产生各种有价值的代谢物，如抗生素、酶、维生素和次生代谢物，可以抗菌或促进植物生长，同时有利于生态环境［20］。其作为一类典型的生防菌，在柑橘上被廣泛研究和报道。例如，枯草芽孢杆菌及其代谢物被用来控制柑橘的绿霉病、青霉病、炭疽病［21-23］。解淀粉芽孢杆菌DH-4对柑橘果实采后青霉菌、绿霉菌也具有显著的抑致活性［24］。此外，枯草芽孢杆菌还被认为具有防控柑橘溃疡病的潜力［25］。

采后病害对柑橘产业造成了严重的经济损失。芽孢杆菌种类多、分布广，在农业生产中应用广泛［26-27］，无毒、绿色、安全和无抗药性等特点使其有潜力成为理想的生防菌。该研究概述芽孢杆菌作为防控柑橘采后病害生防菌的研究进展，以期为柑橘采后病害新型生防菌剂研发或新型防控技术的集成提供参考。

1 生防芽孢杆菌概述

芽孢杆菌种群庞大，繁殖能力强，耐热、耐酸碱、理化性质稳定，抑菌谱广泛［28］。许多已知的芽孢杆菌已被用于防控植物病害，包括解淀粉芽孢杆菌［29］、贝莱斯芽孢杆菌［30］、枯草芽孢杆菌［31］、巨大芽孢杆菌［32］、蜡样芽孢杆菌［33］、苏云金芽孢杆菌［34］、短小芽孢杆菌［35］、地衣芽孢杆菌［36］、多粘类芽孢杆菌［37］、萎缩芽孢杆菌［38］、短短芽孢杆菌［39］、坚强芽孢杆菌［40］等。

2 芽孢杆菌防控柑橘采后病害种类

2.1 绿霉病

由指状青霉（Penicillium digitatum）引起的柑橘绿霉病是柑橘采后贮藏及运输过程中最为严重的病害之一［41］。其常通过各种果实伤口、果蒂切口及蒂缘组织等创口进行侵染［42］。国外有学者利用枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、短芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌防控柠檬果实上的绿霉菌，结果显示均能抑制菌丝生长和孢子萌发［43］。枯草芽孢杆菌内孢子及其无细胞培养上清液（含抗真菌代谢物）对绿霉病菌均有较强的拮抗活性［44］。此外，短小芽孢杆菌和芽孢杆菌W176也可以抑制柑橘果实的绿霉病菌［45］。在国内，2000年，范青等［46］发现枯草芽孢杆菌能够抑制柑橘青、绿霉病。此后，张静等［47］发现枯草芽孢杆菌PY-1发酵液、菌悬液、无菌发酵液、热处理发酵液对柑橘绿霉病的抑制作用依次减弱。2013年，安国栋等［48］从根际土壤中筛选出1株解淀粉芽孢杆菌，对柑橘绿霉病菌具有较强的拮抗活性。另一项研究中，采用酸沉淀法提取解淀粉芽孢杆菌的抗菌物质，得到的抗菌粗提物对柑橘绿霉病菌孢子萌发抑制率为9692%［49］。俞坤辉［50］发现，多粘类芽孢杆菌Y25发酵液对绿霉病菌菌丝生长和孢子萌发具有较好的抑制作用。从广东湛江海域的海底淤泥中分离得到的解淀粉芽孢杆菌HY 2-1，具有耐受高盐的特性，且其发酵上清液对柑橘绿霉病菌指状青霉的抑制稳定性较好［51］。在对沙糖橘的活体试验中，通过解淀粉芽孢杆菌的发酵液、菌悬液及发酵滤液处理，柑橘绿霉病的发生率均低于20%，病斑直径均在10 mm以下［52］。

2.2 青霉病

柑橘青霉病主要由意大利青霉（Penicillium italicum）引起［5］。果实感染后的表征与绿霉病相似，不同在于绿霉病覆盖的菌丝层与分生孢子霉层更厚，且绿霉病的分生孢子通常呈现深绿色，而青霉病的分生孢子呈现蓝绿色。同时，绿霉病比青霉病的发病速率更快且病变更为严重。2001年，秦文等［53］发现芽孢杆菌B4菌株对柑橘青霉病具有良好的防治效果。此后，有学者研究了温度对芽孢杆菌控制柑橘青霉病效果的影响，发现枯草芽孢杆菌磁场诱变株在10 ℃时对青霉病的防效要高于20 ℃时的防效，说明低温抑制了病原菌的生长［54］。而在柑橘果皮的内生菌中，枯草芽孢杆菌对柑橘青霉病菌的抑制作用最为明显［55］。涂起红［56］以新余蜜橘和南丰蜜橘为试验材料，筛选到了对柑橘青霉病和绿霉病抑制作用强的拮抗菌株，经形态学、生理生化及基因等多重鉴定，确定该菌株属类芽孢杆菌。另一项研究也表明，类芽孢杆菌YS-1代谢产物粗提液可抑制意大利青霉分生孢子萌发，且浓度越高，抑制能力越强［57］。

2.3 酸腐病

由柑橘白地霉（Geotrichum citri-aurantii）侵染柑橘引起的酸腐病是仅次于柑橘果实青、绿霉病的一种典型的柑橘采后病害，对全球所有柑橘品种均具有不同程度的危害，造成柑橘产业的损失及环境的潜在污染［58］。枯草芽孢杆菌AF 1被用来控制柠檬酸腐病，其全细胞上清液效果明显高于β-1，4-n-乙酰氨基葡萄糖酶［59］。李登勇等［60］研究发现，解淀粉芽孢杆菌对白地霉的抑菌率为82.58%。当柑橘酸腐病发病率为96.67%时，接种8～10 CFU/mL生防菌能有效降低柑橘酸腐病发病率至13.89%。多项研究证实，解淀粉芽孢杆菌对柑橘绿霉菌、指状青霉、意大利青霉和柑橘酸腐菌均有明显的抑制作用［61-62］。

2.4 炭疽病

由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C.acutatum）引起的柑橘炭疽病，其在柑橘全生育期均可发病，尤以为害果实引起腐烂等造成的损失最大［11］。2010年，汪茜等［63］从辣椒根际土壤中分离出了一株短短芽孢杆菌，其对柑橘炭疽病的防治效果明显，处理后第20天防效仍达64.9%。第二年，该团队又从广西药用植物园鸡血藤的根际土壤中分离得到了对柑橘炭疽病菌具有拮抗活性的枯草芽孢杆菌菌株［64］。

综上，目前芽孢杆菌防控柑橘采后病害种类主要集中在绿霉病和青霉病，酸腐病和炭疽病方面也有少量报道，而对于蒂腐病、黑腐病等其他采后病害的防控研究未见报道，这可能与绿霉病和青霉病是柑橘采后最易发生的病害有关。此外，现有的研究主要集中在利用枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌防控柑橘采后病害，其他种类芽孢杆菌是否对柑橘采后病害防控有益值得进一步研究探讨。

3 作用机制

随着生物防控越来越受重视，生防微生物被广泛发掘，其作用机制也已被逐步解析。目前，生防微生物作用机制主要包括抗菌物质或分解酶的产生、营养和空间竞争、寄生、信号干扰和诱导系统抗性。对于芽孢杆菌属，合成抗菌物质是其最重要的生物防治机制之一［65］，其次是对营养和空间方面的竞争［66］，此外还可以通过间接诱导植物系统抗性［67］。

3.1 产生抗菌物质

已有研究报道了芽孢杆菌属可以生物合成2种抗菌物质：一种是细菌素，由核糖体合成；另一种是脂肽，由非核糖体合成［68］。一般情况下，枯草芽孢杆菌中4%～5%的基因組专门用于合成20多种结构多样的抗菌物质［69］。脂肽受到广泛的关注，可能是由于其理想的特性，如显著的抗菌活性，低毒、抗病毒和抗肿瘤活性，生物降解性和高温稳定性［70］。此外，脂肽被认为比化学物质对环境更安全［71］。

环脂肽（CLPs）是芽孢杆菌合成的主要化合物，主要包括芬枯草菌素、伊枯草菌素A和表面活性素。芬枯草菌素对多种真菌具有拮抗活性，但对细菌和酵母无抑制作用。表面活性素具有很强的抗菌作用［69］。表面活性素和芬枯草菌素是植物诱导系统抗性的诱导因子［23，72］。据报道，解淀粉芽孢杆菌是芽孢杆菌霉素L、芬枯草菌素、表面活性素和伊枯草菌素的共同生产者［73-74］。研究人员在解淀粉杆菌发酵液中发现了2个芽孢杆菌霉素D和大乳蛋白家族成员的3个同源物［75］。枯草芽孢杆菌也可以产生多种抗菌化合物，如辅脂肪酶［67］，细胞外酶，β-1，3-葡聚糖酶［76］和挥发性化合物［61］。

研究发现，芽孢桿菌属w176的无细胞上清液含有的抗霉枯草菌素、bacillaene、大环内酯类抗生素和表面活性素等抗菌化合物可以引起绿霉病原菌细胞空泡化［45］。此外，从类芽孢杆菌YS-1发酵物分离纯化得到的胞嘧啶对意大利青霉具有较强的抑制活性［77］。解淀粉芽孢杆菌HY2-1的发酵上清液含有拮抗柑橘绿霉病菌的活性物质，但是活性化合物的种类和数量还需进一步的分离、鉴定［51］。解淀粉芽孢杆菌RY3粗提物使绿霉病菌细胞膜遭受破坏，透性增大，胞内的电解质外渗，胞内蛋白和糖透过细胞膜大量渗漏［49］。范青等［46］认为，枯草芽孢杆菌B-912抑制柑橘青、绿霉病的作用机理主要是产生抗菌素。地衣芽孢杆菌W10产生的抗菌蛋白对柑橘青霉病菌菌丝形态和生长都有明显的破坏与抑制作用［78］。

虽然芽孢杆菌属的抗菌物质表现出显著的生物活性，但其在某些系统中的生物防治机制尚未明确阐明。枯草芽孢杆菌产生的抗生素在体内工作良好，但在柑橘果实上没有检测到［44］。这表明，抗菌作用可能并不代表枯草芽孢杆菌在果实中的全部拮抗活性。因此，必须考虑果实病变部位的竞争因素。此外，病原菌耐药性不容忽视，这可能成为未来使用生防微生物的障碍［79］。

3.2 竞争营养与空间

微生物之间的相互作用通常涉及对营养物质和空间的竞争，这与它们的生长和发育有关。对营养物质和空间的竞争是最重要的生物防治机制之一，它是酵母和细菌的普遍作用模式［80］。当在果实损伤部位争夺营养物质和空间时，生防微生物需要快速繁殖，并比病原菌更好地适应环境，即使是在使用低浓度的营养物质时也是如此［81］。因此，生防微生物通过耗尽可用的营养物质，来阻止病原菌利用这些营养物质生长繁殖［82］。体内试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7在接种24 h时可定植到脐橙表皮伤口处，通过抢占空间和营养来抑制指状青霉的生长［83］。枯草芽孢杆菌BS-Z菌株分泌的抗菌物质以及与青、绿霉病原菌竞争营养和空间都是其生防机制的组成部分，此外，其能够促进过氧化物酶、超氧化物歧化酶的分泌，有效地降低病原菌引起的丙二醛含量升高，提高柑橘自身的抗病能力［84］。类芽孢杆菌YS-1的菌悬液和上清液均能抑制柑橘青、绿霉病菌孢子的萌发，其抑菌机制为营养和空间竞争，分泌的抗菌物质起主要作用，菌体本身也有抑菌作用［56］。

3.3 诱导抗性

诱导系统抗性（ISR）是指诱导植物宿主产生抗性反应的一种机制。植物可能在不同的植物系统中启动靶基因的表达并激活靶化学物质，以抵御病原体感染［85-86］。防御途径涉及许多生物化学反应，以及病原相关蛋白（PRs）的产生和组织结构的变化。病原相关蛋白在植物被病原菌感染的初始反应阶段合成，可以保护植物免受病原菌的攻击。夏橙果实受到绿霉菌侵染时，枯草芽孢杆菌ABS-S14的环脂肽诱导了相关防御基因的表达，芬枯草菌素增强了葡聚糖酶（GLU）的转录［87］。研究表明，枯草芽孢杆菌ABS-S14自身及其粗提物和壳聚糖可诱导受感染的柑橘果实中过氧化物酶（POX）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性，从而共同抑制绿霉病［23］。芽孢杆菌NCPSJ7和指状青霉复合处理明显降低了脐橙的发病率和病斑直径，提高了果实中多酚氧化酶、过氧化物酶、几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活力，促进果实的总酚含量、总黄酮含量、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清能力和还原力的增加［83］。

综上所述，目前发现的芽孢杆菌防控柑橘采后病害的生防机制主要涉及抗菌物质（如环脂肽和挥发性有机物）的产生、对营养物质和空间的竞争以及诱导系统抗性。林福呈等［88］曾通过扫描电镜观察发现枯草芽孢杆菌吸附在立枯丝核菌的菌丝上，将病原菌菌丝溶解。表明枯草芽孢杆菌具有寄生或溶解病原菌的能力，然而在芽孢杆菌抑制柑橘采后病害病原菌的过程中是否存在该作用机制尚未见到公开报道。因此，将芽孢杆菌拮抗菌和柑橘采后病害病原菌置于体内或体外密切接触的策略，可能有助于是否存在寄生或溶解作用机制的研究。

4 结语和展望

枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌属拮抗菌可以通过产生抗菌物质、竞争营养物质和空间、诱导系统抗性等防控柑橘青、绿霉病等采后病害。生防芽孢杆菌制剂的研发与应用在柑橘采后病害防控领域具有广阔的应用前景。然而，单独使用生防芽孢杆菌并不能实现对柑橘采后病害的完全控制。但是，芽孢杆菌与其他生物、化学物质联合应用的策略为控制柑橘采后病害提供了潜力。解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌与热水和碳酸氢钠对青霉、绿霉和酸腐病有较强的抑制作用，解淀粉芽孢杆菌加茶皂苷的防控效果超过90%［89-90］。枯草芽孢杆菌与季也蒙毕赤酵母组合完全抑制绿霉菌而不损害柑橘果实品质［91］。盐被发现是控制柑橘采后病害的一种有用的田间防控策略，在果实采前和采后同时应用更有效［92］。因此，可以将盐和生防芽孢杆菌组合纳入控制柑橘采后病害的综合方法。此外，有必要开展生防芽孢杆菌与新型抑菌物质的组合、不同种类生防芽孢杆菌之间的组合防控柑橘采后病害的研究。

生防芽孢杆菌菌体及其代谢产物对环境条件要求较高，这也是目前商业化的产品较少以及生产应用效果不明显的重要原因。因此，基于基因组学、代谢组学等现代技术深入发掘具有广谱抗菌活性且生存能力强的生防菌株，同时系统解析生防芽孢杆菌的作用机理等工作应作为未来研究重点。

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作者简介   刘雪峰（1990—），男，河南商丘人，助理研究员，硕士，从事果树学研究。

通信作者，助理研究员，硕士，从事果树学研究。