基于矿物元素结合化学计量学方法实现烟叶溯源

苏赞 林涛 胡逸超 程新胜

摘要［目的］通过测定烟叶矿物元素的含量结合化学计量学方法建立关于烟叶溯源的特征指纹图谱，并对方法的准确性和可靠性进行验证。［方法］采用电感耦合等离子发射光谱仪结合微波湿法消解分析种植于5个不同地区土壤的25个烟叶样品中矿物元素的含量，对所得到的元素含量进行单因素方差分析、主成分分析和典型判别分析。［结果］种植于不同地区土壤的烟叶中矿物元素含量存在明显差异。利用主成分分析得到的前2个主成分能够充分反映原始数据信息，并且利用对烟叶中矿物元素含量的分析，实现了种植于不同地域土壤中烟叶的产地溯源。结合Fisher判别分析进行验证并用“留一法”进行交叉检验，得到了理想的验证结果，其正确判别率均达到了100%。［结论］基于烟叶中矿物元素含量的特异性差异可以对烟叶进行正确的溯源分析。

关键词烟草；矿物元素；化学计量学；地理来源；主成分分析；判别分析

中图分类号TS47  文献标识码A  文章编号05176611（2024）07019204

doi：10.3969/j.issn.05176611.2024.07.045

Geographical Identification of Tobacco Leaf Based on Inorganic Elements Combine Chemometrics Method

SU Zan1， LIN Tao2， HU Yi-chao1 et al

（1.China Tobacco Guangxi Industrial Co.，Ltd.，Nanning，Guangxi 530001;2.Institute of Advanced Technology， University of Science and Technology of China， Hefei，Anhui 230000）

Abstract［Objective］To establish the characteristic fingerprint of tobacco traceability by the determination of mineral elements in tobacco leaves combined with chemometrics method， and to verify the accuracy and reliability of the method. ［Method］The contents of inorganic elements in 25 tobacco leaf samples planted in soils from five different areas were analyzed by ICP-OES combined with microwave digestion method. The data matrix was sequentially analyzed by one-way-ANOVA， principal component analysis and discriminant analysis. ［Result］There were significant differences among tobacco leaves planted in different soils about the contents of mineral elements. The first two principal components obtained by principal component analysis could approximately reflect the information of original data， and realized the traceability of tobacco planted in soils from different regions by analyzing the mineral elements contents. Fisher discriminant analysis and leave-one-out cross-validation test were performed to validate these results， ideal verification results were obtained， and the correct discrimination rate were 100%， respectively.［Conclusion］Based on the specific differences of inorganic elements could discriminate the geographical origins of tobacco.

Key wordsTobacco;Mineral element;Chemometrics;Geographical origin;Principal component analysis;Discriminant analysis

建立一套高效的煙叶追溯系统不仅能够防止非法烟叶流入市场、维持烟叶稳定生产，有助于保护烟草种植者的利益，并确保终端卷烟生产企业得到稳定的原料供应。烟叶溯源有助于卷烟企业确定烟叶原料的原产地和特征，并向下游企业和顾客反馈产品质量信息；烟叶供应链上的企业在发现烟叶质量、安全性问题时追溯其来源，确定问题所在及形成的原因。

植物源性农产品溯源技术目前在国际上已经得到了快速发展与应用。农产品溯源是基于产自不同地域农产品中的特异性指标，建立指纹图谱库进行对不同地区的同类产品进行区分鉴别。如利用矿物元素鉴别植源性农产品来源的理论基础是这些农产品不能自发地合成这些矿物元素，只能从土壤中获取这些元素，不同类型土壤的理化性质和有机物质组成有较大的差异，植物矿物元素组成与土壤组成有着直接关系，从而导致其栽培的农作物中化学成分含量有很大差异；与此同时大部分矿物元素的理化性质稳定，短时间内很难自发流失［12］。国际上已经有很多利用农产品中矿物元素的差异结合化学计量学方法对一些农产品（如蜂蜜［3］、水稻［4］、小麦［5］、牛奶［6］、柑橘［7］、大蒜［8］、葡萄酒［9］等）进行溯源鉴别分析的报道。有关烟叶中矿物元素的研究也有很多［1011］，但是关于利用矿物元素对烟叶进行溯源的研究却鲜见报道。该试验采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪测定烟叶中铝（Al）、钙（Ca）、锰（Mn）、铁（Fe）、锌（Zn）、铬（Cr）、锶（Sr）7种目标矿质元素的含量，结合化学计量学方法对烟叶进行溯源分析，旨在为烟叶产地溯源建立指纹图谱数据库模型提供参考。

1材料与方法

1.1试材

硝酸（68%）、高氯酸（70%）、过氧化氢（30%），上海国药试剂有限公司，所有试剂级别都是优级纯；1 000 mg/L的Al、Ca、Mn、Fe、Zn、Cr、Sr单元素标准溶液购买自中国钢铁研究院，使用前用超纯水稀释成一系列不同的浓度；生物标准参考物质灌木枝叶组合样GBW 07603购买于地矿部物化探研究所；超纯水（18 MΩ/cm）由MilliQ Element系统制备得到。

1.2仪器

Optima 7300DV 电感耦合等离子体发射光谱仪（ICPOES）购自美国珀金埃尔默仪器公司；电子分析天平（精确度0.000 1 g）购自上海精密科学仪器有限公司；FA1004冷冻干燥机购自上海比朗科技公司；MARS微波消解仪购于美国培安CEM公司；MilliQ超纯水仪购自美国Millipore公司。试验过程中所有的器皿使用前均用10%的稀硝酸浸泡，然后冲洗干净烘干后再使用。

1.3试验方法

1.3.1样品采集。

从安徽芜湖、广东韶关、福建三明、云南曲靖和安徽合肥5个地区采集土样。采样地点地理信息如表1所示，以上这5个采样地区（合肥除外）都是我国重要的烟叶种植区域［12］。采样地点在烟草生产地块中随机选取的，取样方法采用五点取样法，且采样土壤的前茬作物均是烟草。取表层土（15～30 cm深）约50 kg并带回实验室，在种植烟叶之前，将土壤中的腐根和烂叶去除。将呈块状的土壤弄碎，所有土壤准确加入相同比例的烟叶复合肥［13］（N∶P2O5∶K2O=1∶1∶3）（质量比400∶1，土壤∶复合肥），然后分为8份，每份装入同一大小的口径约为20 cm的塑料盆钵中待移栽烟叶幼苗。

烟苗（云烟97）是取自安徽省烟草公司皖南烟叶公司，选取长势一致的烟苗，移栽到装有不同地区土壤的塑料盆钵中，每隔3 d浇灌一次清水，初花期打顶，每株保留16片叶，待中部叶成熟后，一次性采集中部8片叶（下面去4片、顶部去4片），每种土壤处理选取5株长势相同的烟株，将各单株叶片采收后悬于室内避光处晾制，晾制前用毛刷去除烟叶表面粉尘与杂物。30 d后将各单株叶片烘干，干燥后用研钵粉碎，过100目（150 μm）筛，然后用塑料密封袋密封并标记冷藏保存，待进一步分析。

分别收集5份土壤样品在70 ℃的恒温干燥箱内烘干过夜，用研缽研碎并过100目筛，然后用塑料密封袋密封并标记冷藏保存，待进一步分析。

1.3.2样品制备。

准确称量均质化的烟叶粉末0.5 g（精确到0.000 1 g）并转移至聚四氟乙烯（PFA）消解罐中，加入4 mL浓HNO3、1 mL HClO4和1 mL H2O2后静置过夜，第2天再加入2 mL硝酸，然后装入消解罐内再放入微波消解仪内，并按照表2所示的升温程序进行消解［1011］。消解完毕待温度降至低于40 ℃后取出消解罐，将消解后的澄清溶液转移至聚对苯二甲酸类塑料（PETP）容量瓶中，用超纯水洗涤PFA消解罐3次，洗涤液也转移至容量瓶中，用超纯水定容至100 mL。采用上述相同的方法消解3个灌木枝叶标准品，并制备一组溶剂空白溶液。

1.3.3无机元素测定。

由于ICPOES具有优良的重现性和精确度，常用来测定动植物组织中矿物元素的含量［2，813］。该试验采用ICPOES对烟叶中目标矿物元素进行测定，结合前人的检测方法［1417］，此次试验中所选的波长如表3所示。

1.4数据分析

对烟叶中的所有原始数据统一浓度（平均值±方差，mg/kg）表示。为消除不同元素之间的差异性，在进行数据分析之前对所有原始数据进行标准化。利用单因素方差分析比较分析不同土壤种植的烟叶样品中矿物元素的差异，利用主成分分析将25个烟叶样品进行聚类分析，再利用Fisher函数典型判别分析评估验证主成分分析聚类方法对烟叶种植土壤来源的判别的可行性和准确性［18］。主成分分析和典型判别分析都是通过降维的思想，在原始信息大部分被保留的前提下，将多个变量转化为几个综合变量的多元统计分析方法［1820］。不同于主成分分析，典型判别分析是有管理模式的模式识别方法，也就是说主成分分析是无监督式学习而典型判别分析是监督式学习［1820］。“留一法”交叉验证的原理是每个样品数据都是按照从该数据矩阵以外的所有其他数据集派生的函数来进行分类［19］。以上所有数据分析都是利用IBM SPSS 19.0和MATLAB 2010来实现。

2结果与分析

2.1矿物元素分析方法准确度检验

为了考察所选用的微波消解结合ICPOES检测方法测定烟叶中矿物元素含量的准确性和可靠性，试验过程中平行测定了国家一级标准物质灌木枝叶（GBW 07603）［2122］，测定的值均在参考值范围内（表3），表明该方法适用于植物组织的矿物元素含量的测定。回收率的测定方法是随机挑选一个已测烟叶样品，然后加入一定浓度的标准样品，再次检测浓度，回收率在89.7%～106.2%，说明稳定性良好。参照BrzezichaCirocka等［23］的方法，将空白溶液平均值加上3倍标准偏差定义为检出限（LOD），由表3可知，7种矿质元素的检出限为0.010～0.538 μg/g。

2.2烟叶中矿物元素的含量

分别对种植在5个不同地区土壤的烟叶中矿物元素含量进行检测并进行方差分析，结果发现（表4），种植在不同地区土壤上的烟叶中所有目标元素（Al、Ca、Mn、Fe、Zn、Cr、Sr）间均存在明显差异，说明土壤对烟叶中矿物元素含量的影响明显。烟叶中矿物元素含量从大到小依次是Ca>Fe>Al>Mn>Sr>Zn>Cr。

2.3主成分分析

利用上述7个元素作为分析参数因子，对5个地区的烟叶样品进行产地主成分分析。通过主成分分析，得到6个有效主成分，选取第1、第2主成分进行得分分析。第1主成分贡献率为46.109%，第2主成分贡献率为28.623%，前2个主成分的累计贡献率达到了74.732%，达到可充分反映原始数据信息的要求［24］。此外，基于这些元素进行主成分分析的KaiserMeyerOlkin（KMO）检测结果是0.517，巴特利特球形检验的结果为df=21，P<0.001，表明使用7个元素的浓度数值作为参数指标进行主成分分析是可行的［25］。各主成分荷载表达式（F1、F2）如下所示：

F1=0.359Al0.469Ca+0.456Mn+0.280Fe+0.061Zn+0.358Cr0.481Sr

F2=0.062Al0.337Ca+0.334Mn0.571Fe+0.607Zn0.152Cr+0.230Sr

以第1、第2主成分作為坐标系，将25个烟叶样品进行聚类分析的得分图如图1所示。第1、第2主成分可以将25个烟叶样品完全正确区分，判别准确率达到100%。

2.4典型判别分析为了验证主成分分析的分类结果，对7个元素含量的数据矩阵进行Fisher典型判别分析，典型判别分析函数系数表达式如下：

函数1=0.765Al0.197Ca+0.553Mn+1.892Fe0.120Zn0.035Cr2.188Sr

函数2=0.292Al0.341Ca+0.788Mn0.878Fe+0.578Zn0.177Cr+0.915Sr

从图2和表5可以看出，利用判别分析能够将25个烟叶样品完全区分，准确率达到了100%，采用“留一法”对数据进行交叉验证，交叉验证的准确率也是100%。

3结论

该研究采用电感耦合等离子发射光谱仪结合微波湿法消解分析了种植于5个不同地区土壤的25个烟叶样品中矿物元素的含量，对所得到的元素含量进行单因素方差分析、主成分分析和典型判别分析。结果发现种植于不同地区土壤的烟叶中矿物元素含量存在明显差异，表明植物体内的生物元素组成与土壤密切相关。利用主成分分析得到的前2个主成分能够充分反映原始数据信息，并且利用对烟叶中矿物元素含量的分析，实现了种植于不同地域土壤中烟叶的产地溯源。将矿物元素作为因素进行Fisher函数典型判别分析在小范围内区分烟叶植株的来源，其初始正确率达到了100%，用“留一法”进行交叉验证检验的正确识别率同样达到100%，说明可以通过烟叶中的矿物元素含量差异对烟叶进行溯源。建立基于矿物元素结合化学计量学方法可以为烟叶生产和进出口质量控制建立指纹图谱数据库模型提供参考依据，可以对烟叶进行快速溯源鉴别。此外，对于今后烟叶种植过程中应根据不同地域的背景差异从有机肥料和特殊比例复合肥料等方面进行深入研究。

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基金项目广西中烟工业有限责任公司资助项目（2021450000340033）。

作者简介苏赞（1980—），男，广西梧州人，农艺师，从事烟叶原料质量研究。

通信作者，农艺师，硕士，从事植物病理和生物技术研究。