低级别胶质瘤自噬相关基因预后分类器的构建及验证

李国俊 刘妲 李永事 邓仕凤 李会兵 山常国 金鑫

【摘要】目的本研究旨在构建自噬相关基因（ARGs）的风险分类器，从而预测低级别胶质瘤（LGG）患者的生存率。方法从UCSCXena，CGGA，GlioVis和GTEx公共数据库中获取LGG患者和正常脑组织数据，结合人类自噬数据库筛选出232个ARGs。通过差异分析得到差异ARGs。在训练集中，利用单因素Cox回归分析和LASSO回归分析，构建ARGs的预后分类器。通过绘制受试者工作特征（ROC）曲线确定最佳Cut-off值。Kaplan-Meier生存曲线和ROC曲线下面积（AUC）用于评估分类器性能，并在内部数据集和外部数据集中验证。Cox回归分析用于评估分类器的独立预后价值。最后，结合常见临床参数和风险分类用于构建列线图模型，并利用ROC曲线，一致性指数和校准曲线评估该模型的预测能力。结果本研究构建了由6个ARGs（BAG1、PTK6、EEF2、PEA15、ITGA6和MAP1LC3C）的预后风险分类器，其可将LGG患者分為具有明显生存差异的高、低风险组在多个数据集（均P＜0.05）。5年AUC值显示该分类器在训练集，内部验证集和TCGA总集中分别为0.837，0.755，和0.803。同时，在外部验证集中，1年，2年和3年ROC曲线依然提示该分类器具有较好的预测准确性。Cox回归分析显示该预后分类器在来自TCGA的多个数据集中都具有独立预后价值（HR>1，P<0.05）。之后构建了包含多个常见临床参数和预后风险分类的列线图模型，时间依赖性ROC，一致性指数（C-index）和校准曲线分析同时证实了该模型的预后价值。结论本研究建立了一个由6个ARGs的具有高预后价值的风险分类器，并结合临床病理特征和风险分类构建了用于临床决策的列线图，能更好地帮助临床医生判断LGG患者的预后和进行个体化治疗的临床决策。

【关键词】低级别胶质瘤；自噬相关基因；预后分类器；临床意义

【中图分类号】R739.41【文献标志码】A【文章编号】1672-7770（2024）01-0023-09

Constructionandvalidationanovelsixautophagy-relatedgenessignatureinlower-gradegliomaLIGuojun，LIUDa，LIYongshi，etal.DepartmentofNeurosurgery，GuangdongSanjiuBrainHospital，Guangzhou510510，China

Correspondingauthor：JINXin

Abstract：ObjectiveToconstructariskclassifierforautophagyrelatedgenes（ARGs）topredictthesurvivalrateoflow-gradeglioma（LGG）patients.MethodsLGGpatientandnormalbraintissuedatawereobtainedfromthepublicdatabasesofUCSCXena，CGGA，GlioVis，andGTEx，andscreen232ARGsusingahumanautophagydatabase.DifferentialARGswereobtainedthroughdifferentialanalysis.Inthetrainingset，aprognosticclassifierforARGswasconstructedusingunivariateCoxregressionanalysisandLASSOregressionanalysis.TheoptimalCut-offvaluewasdeterminedbydrawingreceiveroperatingcharacteristic（ROC）curves.TheKaplanMeiersurvivalcurveandareaundertheROCcurve（AUC）wereusedtoevaluateclassifierperformanceandvalidatedonbothinternalandexternaldatasets.Coxregressionanalysiswasusedtoevaluatetheindependentprognosticvalueofclassifiers.Finally，acolumnchartmodelwasconstructedusingcommonclinicalparametersandriskclassification，andthepredictiveabilityofthemodelwasevaluatedusingROCcurves，consistencyindices，andcalibrationcurves.ResultsThisstudyconstructedaprognosticriskclassifierconsistingofsixARGs（BAG1，PTK6，EEF2，PEA15，  ITGA6， and MAP1LC3C）， which can classify LGG patients into high-risk and low-risk groups with significant survival differences across multiple datasets（all P<0.05）. The 5-year AUC value shows that the classifier has values of 0.837， 0.755， and 0.803 in the training set， internal validation set， and TCGA total set， respectively. Meanwhile， in the external validation set， the ROC curves for 1 year， 2 years， and 3 years still indicated that the classifier has good predictive accuracy. Cox regression analysis showed that the prognostic classifier had independent prognostic value in multiple datasets from TCGA（HR>1，P<0.05）. Afterwards， a column chart model containing multiple common clinical parameters and prognostic risk classification was constructed， and the prognostic value of the model was confirmed through time dependent ROC（t-ROC）， consistency index（C-index）， and calibration curve analysis. ConclusionA risk classifier with high prognostic value is established consisting of 6 ARGs， and combined clinical pathological features and risk classification to construct a column chart for clinical decision-making， which can better assist clinical doctors in judging the prognosis of LGG patients and making personalized treatment clinical decisions.

Key words： lower-grade glioma; autophagy related gene; prognostic classifier; clinical revelance

低级别胶质瘤（lower-gradeglioma，LGG）包括弥漫性低级别和中级别胶质瘤［世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）Ⅱ和Ⅲ级］，其约占原发脑肿瘤的30%，来源于神经胶质细胞，具有临床预后差异性大的特点［1-2］。目前最大程度手术切除联合术后放化疗仍是LGG的主要治疗模式［3-4］。虽然有近一半LGG患者术后生存时间较长，但还有一半以上的患者可能迅速发展成为难治性和侵袭性的高级别胶质瘤，从而极大缩短患者的生存时间［5-6］。因此，寻找新的LGG预后标志物和治疗靶点已迫在眉睫。

自噬是一种高度保守的溶酶体降解过程，对于体内平衡、分化、发育和存活至关重要［7］，并被发现参与多种病理过程，包括癌症［8］。通过自我降解受损的蛋白质和细胞内成分，自噬可以抑制肿瘤的发生，从而减轻细胞损伤和抑制染色体不稳定［9-11］。但是，在乏氧和营养缺乏的环境中，自噬也可以通过提供营养物质促进癌细胞的增殖。自噬目前被认为具有阻止癌症的发生和促进肿瘤进展的双面作用［12］。然而，很少有研究报道自噬对LGG预后的影响。

本研究通过差异分析，单因素Cox回归和LASSO回归分析，筛选出6个自噬相关基因，用于建立一个强有力的预后风险分类器，然后利用风险分类和传统的临床参数建立了列线图，以期提高预测临床预后准确性和辅助临床决策。

1材料与方法

1.1数据收集和预处理从UCSCXena（https：//xenabrowser.net/）网站下载529例癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）中LGG患者的RNA-seq表达谱及其临床病理资料。将病理诊断为LGG，随访时间大于90d，且有完整临床资料的LGG患者纳入本研究，最后共有433例LGG患者纳入，并将其作为TCGA总集。之后将TCG-总集中的433例LGG患者以7∶3的比例，随机分为内部训练集（n=305例）和内部验证集（n=128例）。此外，从中国脑胶质瘤基因组图谱计划（ChineseGliomaGenomeAtlas，CGGA）数据库［13］下载了mRNAseq_693和mRNAseq_325数据集，作为本研究的CGGA1和CGGA2外部验证数据集，并从脑肿瘤表达数据可视化和分析数据库（GlioVis-VisualizationToolsforGliomaDatasets，GlioVis）［14］下载了Gravendeel和Rembrandt数据集作为另外2个外部验证数据集。正常脑组织mRNA表达谱资料自基因型-组织表达（genotype-tissueexpression，GTEX）数据库中下载。此外为了校准mRNA表达谱数据，消除批次效应，使用了“sva”R包的“combat”算法。

1.2自噬相关基因的筛选及其功能的富集使用R软件中“limma”包对TCGA-LGG肿瘤样本和正常脑组织进行差异分析，以FDR<0.05且|Log2FC|>1为筛选标准，筛选出差异表达基因（differentiallyexpressedgenes，DEGs），并用火山图进行可视化展示。从人类自噬数据库（HADb，www.autophagy.lu/）中提取的232个自噬相关基因（autophagyrelatedgenes，ARGs）。将DEGs和自噬相关基因相交，得到53个差异表达的自噬相关基因（differentiallyexpressed-autophagyrelatedgenes，DE-ARGs），并以Venn图展示。之后对DE-ARGs进行基因本体论（GeneOntology，GO）和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）功能富集分析。

1.3基于ARGs的风险分类器的构建与验证对训练集中53个DE-ARGs进行单因素Cox回归分析，得到13个具有显著预后差异的DE-ARGs（均P<0.05）。然后采用LASSO回归模型对这13个DE-ARGs进行进一步筛选，从而建立由6个ARGs构成的能预测LGG患者预后风险的分类器模型。将LASSO回归系数与相应基因的归一化表达水平相结合，建立风险分类器模型，其风险评分=各基因的归一化的mRNA表达水平×相应的LASSO回归系数的总和。随后，对每个患者计算风险评分，并根据由受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，ROC）曲线计算得到的最佳的风险分界值（-7.009），将所有LGG患者分为高、低风险组。其次，利用Kaplan-Meier生存分析的Log-rank检验评估高风险组和低风险组患者的生存差异。同时使用“survcomp”和“survivalROC”R包的一致性指数（C-index）分析和时间依赖性ROC（time-dependentROC，tROC）曲线分析来判断该预后分类器模型在多个数据集中的预测能力。此外，采用Cox回归分析方法评估预后风险分类器模型在多个数据集中的预测能力是否可以独立于其他临床因素，包括年龄、性别、WHO分级、放疗、化疗和异柠檬酸脱氢酶（isocitricdehydrogenase，IDH）状态。接下来，通过使用“rms”，“foreign”和“survival”R软件包，本研究建立了一个基于常见临床病理因素和风险分类组成的用于临床决策的列线图；并利用C-index，tROC和校准曲线分析，以评估列线图的预测效能。

1.4统计学方法数据分析和绘图主要基于R-3.6.3（https：//www.r-project.org）完成。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線的Log-rank检验，并用荟萃分析方法分析自噬相关风险分类器在整合数据集中的预后价值；独立预后因素的评估，使用单因素和多因素Cox回归分析。预后风险分类器的预测效能通过，一致性指数分析和tROC曲线分析；临床决策的列线图，使用“rms”R包中的多因素Cox回归分析函数来构建。并且列线图的预测效能，通过一致性指数，tROC曲线和刻线图来评估。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1差异表达ARGs的筛选及功能富集分析对从TCGA-LGG收集的529例低级别胶质瘤组织和从GTEX中收集1035例正常脑组织进行差异分析，得到7143个DEGs，并在火山图中展示（图1A）。将这些DEGs与来自HDAb的232个ARGs取交集，韦恩图显示有53个DE-ARGs，用于进一步分析（图1B）。对53个DE-ARGs进行GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能富集显示，在生物学过程方面，DE-ARGs主要富集在自噬相关过程；在细胞成分方面，DE-ARGs主要富集在自噬体膜、自噬体和空泡膜，在分子功能方面，DE-ARGs主要富集在泛素和泛素样蛋白连接酶结合，以及周期素依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂活性方面（图1C）。此外KEGG通路富集显示，DE-ARGs主要在肿瘤相关通路、自噬-动物和吞噬-动物方面富集（图1D）。

2.2预后风险分类器的建立与评估采用“caret”R包，将433例TCGA-LGG患者随机分成训练集（n=305）和内部验证集（n=128）。对两个数据集之间的基本临床因素进行χ2检验，结果显示两个数据集之间没有显著差异（表1）。之后通过对53个DE-ARGs进行单因素Cox回归分析，在训练集中得到13个与预后显著相关的DE-ARGs。将这13个ARGs纳入LASSOCOX回归分析识别更稳定，与预后更相关的基因，本研究最终筛出6个ARGs，构建了LGG预后风险分类器，分别是BAG1，PTK6，EEF2，PEA15，ITGA6和MAP1LC3C。其中BAG1、PTK6、EEF2和PEA15的风险比（hazardratio，HR）<1，提示低表达与高风险相关；ITGA6和MAP1LC3C的HR>1，提示高表达与高风险相关，6个基因的生存分析和LASSO回归系数见表2。根据6个ARGs的LASSO回归系数和相对应的mRNA表达量计算每个LGG样本的风险评分。随后，本研究计算出训练集中每个LGG样本的风险评分，绘制ROC曲线得到风险评分的最佳截断值（cut-offvalue，-7.009），以此将LGG患者分为低风险组和高风险组（图2D）。Kaplan-Meier生存分析显示，与低风险组相比，高风险组患者的总生存期（overallsurvival，OS）显著较差（Log-rankP<0.0001，圖2A）。tROC曲线结果如图2B所示，预后风险分类器的5年时间AUC值最高为0.837，明显高于其他临床病理因素。图2C显示了高低风险组之间的六个ARGs表达量分布情况。此外，风险评分在单因素和多因素Cox回归分析结果中均具有显著统计学差异（HR>1，P<0.05）。上述结果表明，风险分类器对LGG患者的预后预测较其他临床指标具有更好的预测性能。

2.3预后风险分类器的验证利用内部验证数据集和TCGA总数据集对预后风险分类器的预测能力进行验证。根据最佳Cut-off值（-7.009），将内部验证集（图3D）分为高风险组（n=44）和低风险组（n=84）。Kaplan-Meier生存曲线显示，高风险组患者的预后OS较低风险组更差（Log-rankP<0.0001，图3A）。5年时间的ROC曲线分析结果显示，在各临床参数中，风险评分对OS具有最好的预测能力（AUC=0.755，图3B），优于其他单个临床参数。6个ARGs的表达量在验证队列中的分布情况以热图形式展示（图3C）。此外，将年龄、性别、WHO分级、放疗、化疗和IDH状态以及风险评分纳入Cox回归分析，结果显示风险评分仍是LGG患者的独立预后因素（HR>1，P<0.05，表3）。然后本研究进一步证明了自噬相关的预后分析分类器在TCGA总数据集中的预测能力，并得到了相似的结果。如图4D所示，采用最佳Cut-off值将TCGA-总数据集分为具有显著生存差异的高风险组和低风险组（Log-rankP值<0.0001，图4A）。5年时间ROC曲线结果也得出风险评分对LGG患者OS的预测能力最佳（AUC=0.803），优于其他传统临床病理因素（图4B）。在TCGA总数据队列中，高低风险组之间的6个ARGs自噬表达量情况以热图形式展示（图4C）。Cox回归分析结果仍提示，风险评分是OS的独立预后因素（表3）。此外，本研究还纳入了来自CGGA数据库的CGGA1和CGGA2低级别胶质瘤转录组数据集和来自GlioVis数据库的GRAVENDEEL和REMBRANDT数据集作为外部数据集来验证该ARGs风险分类器。首先根据该分类器的计算公式对数据集中每个样本进行打分，然后利用ROC曲线得到风险评分的最佳截断值，用于划分高、低风险组。图5A，5C，5E，5G显示，高风险组中患者的预后OS均显著短于低风险组（Log-rankP值均＜0.05）。同时1年，2年和3年ROC曲线结果提示，该模型具有良好的预测准确性（图5B，5D，5F，5H）。最后对来自TCGA，CGGA和GlioVis数据库的5个数据集进行荟萃分析，结果显示该ARGs风险分类器在整合数据集和其他四个外部验证集中具有显著预后价值（表4）。综上，自噬相关的预后风险分类器在预测LGG患者的临床预后生存中具有良好的预测性能。

2.4临床列线图的建立和验证通过结合风险分类和常见的临床病理因素，本研究构建了一个用于临床决策的列线图来预测TCGA总数据集中LGG患者的3年和5年的生存概率（图6B）。一致性指数和tROC曲线分析用于评估临床列线图的预测效能，结果提示C-index为0.845，3年和5年的AUC值分别为0.884和0.855（图6A）；同时，校准曲线图结果提示3年和5年生存概率的预测值和实际值吻合度高在训练集（图6C、D），验证集（图6E、F）和总体数据集（图6G、H）。这些结果提示，临床列线图能准确地预测LGG患者的生存概率。

3讨论

研究报道自噬参与多种癌症（包括胶质瘤）的发生、发展和耐药［8，15-16］，然而ARGsLGG中的具体功能和临床意义尚不清晰。因此，构建自噬相关预后分类器具有重要意义。本研究最终构建了一个能高效预测LGG患者预后的分类器模型，并进一步构建了用于临床决策的列线图，为LGG患者的个体化治疗提供了一个新方向。

本研究通过单因素Cox回归、LASSO回归和多因素Cox回归分析，确定了6个与预后有显著相关的ARGs，其中BAG1、PTK6、EEF2和PEA15是低级别胶质瘤患者的保护因素，ITGA6和MAP1LC3C是LGG患者的危险因素。BAG1是一种多功能蛋白，有报道显示抑制BAG1表达能引起细胞凋亡，细胞周期阻滞，甚至能增加细胞的化疗敏感性［17］。PTK6编码一种细胞质非受体蛋白激酶，在癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭过程起着重要作用［18］。PTK6在多种癌症组织中高表达，并与不良临床预后相关［19-20］。然而，另一项研究表明，PTK6在喉鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌组织中低表达，并与更差的生存时间相关［21-22］。EEF2在蛋白质合成过程中参与肽基tRNA的转运。沉默EEF2能增加癌细胞的线粒体延长，细胞自噬和顺铂敏感性［23］。PEA15是一种15-kda的磷酸化蛋白，通过结合ERK蛋白，阻止ERK蛋白的核定位，从而ERK-依赖的基因转录和细胞增殖过程［24-25］。此外，PEA15还可通过激活ERK1/2通路诱导细胞自噬。ITGA6是整合素α链家族的一员，在细胞外间质蛋白的信号传导，和在多种癌症的耐药性中发挥关键作用［26-27］。ITGA6的高表达水平与较短的OS有关［28-29］。MAP1LC3A编码微管组织蛋白1-lightchain3家族的一个轻链亚基，参与细胞自噬和细胞移动过程。Giatromanolaki等［30］指出MAP1LC3A的过度表达与自噬降解活性受损有关，这可能促进了胶质母细胞瘤的致癌过程。此外，另一项研究表明，MAP1LC3A在口腔鳞状细胞癌手术切缘的表达可能是临床预后不良的生物标志物［31］。综上所述，BAG1、PTK6、EEF2、PEA15、ITGA6和MAP1LC3C可作为多种肿瘤生存的预测因子，参与包括自噬在内的多种生物学过程。这些ATGs可作为指导LGG治疗的预后生物标志物和潜在治疗靶点。

本研究根据上述6个ARGs构建了一个新的预测风险分类器，用于提高预测LGG患者的生存准确性。在来自TCGA的多个数据集中，利用Kaplan-Meier生存曲线证明高风险组患者相比于低风险组患者的预后都更差，在4个外部数据集和1个整合数据集中，同样观察到相似的结果；tROC曲线也得出，该预测风险分类器较其他临床病理因素具有更高的AUC值，表明该预测风险分类器具有良好的可重复性和预测准确性。此外，Cox回归分析指出，预测分类器的风险评分可能是个预测LGG患者的独立预后因素，并在多个数据集中得到验证。最后，为了提高风险评分的预测效能，本研究构建了一个包含风险分组、年龄、性别、WHO分级、放疗、化疗和IDH状态的列线图。通过ROC曲线分析，列线图的预测准确性优于风险评分和单一临床参数，并且校正曲线分析显示列线图预测的生存概率与实际生存率非常接近，这能更好地为临床医生提供个体化治疗指导。然而，本研究也存在一定的局限性。首先，本研究中的LGG数据都是来自公共数据集，因此未来在自己的数据集中验证该风险分类器会更好地促进其指导临床决策的能力。其次，ARGs在LGG中的分子机制尚需要实验研究的探索。

综上所述，本研究构建了一个基于6个ARGs的风险分类器来预测LGG患者的生存风险。然后，结合风险分类和临床病理特征构建了列线图模型以预测LGG患者的预后生存时间，与单一临床病理特征相比，列线图模型具有更准确的预测性能，有助于临床医生进行个体化治疗的临床决策。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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（收稿2022-07-15修回2023-01-23）