下调RNA去甲基化酶FTO的表达对胶质母细胞瘤干细胞功能的影响

温翠侠 田聪 王万洲 张旭

【摘要】目的分析下调N6-甲基酰胺（m6A）去甲基化酶脂肪组织和肥胖相关蛋白（FTO）的表达对人胶质母细胞瘤干细胞（GSC）增殖与干性维持的影响。方法构建稳定下调FTO表达的干细胞株，运用CCK-8法检测下调FTO对GSC细胞增殖的影响；应用神经球形成实验检测两组细胞神经球形成能力的变化；运用体外有限稀释实验检测两组细胞自我更新能力的影响；流式细胞术检测下调FTO对GSC细胞凋亡的调控作用。结果CCK-8结果显示，与对照组相比，下调FTO表达后减慢了GSC细胞生长速度。成球实验结果表明实验组的GSC神经球大小和数量较对照组显著减少。体外有限稀释实验结果显示，下调FTO表达后神经球自我更新能力减弱；流式细胞术检测凋亡显示，下调FTO表达后增加了GSC细胞凋亡率。结论下调FTO的表达可抑制GSC的生长与自我更新能力，靶向FTO可能是清除GSC的潜在策略之一。

【关键词】FTO；胶质母细胞瘤干细胞；神经球；凋亡

【中图分类号】R739.41【文献标志码】A【文章编号】1672-7770（2024）01-0038-05

Effect of downregulation of RNA demethylase FTO expression on glioblastoma stem cell function WEN Cuixia， TIAN Cong， WANG Wanzhou， et al. XuZhou Institute of Medical Science， Xuzhou 221009， China

Corresponding author： ZHANG Xu

Abstract： ObjectiveTo analyze the effects of down-regulated expression of m6A demethylase FTO on the proliferation and maintenance of glioblastoma stem cells（GSCs）. MethodsFTO knock-down glioma stem cells were generated to detect the effect of down-regulated FTO on GSC cell proliferation. The neurosphere formation ability of two groups of GSC cells was assessed by neurosphere formation experiment. In vitro limited dilution assays were used to examine the effects on self-renewal ability of GSC cells after FTO knockdown. Flow cytometry was used to detect the effect of down-regulated FTO on apoptosis of GSC cells. ResultsThe CCK-8 results showed that compared with the control group， downregulation of FTO expression slowed down the growth rate of GSC cells. The results of the ball formation experiment showed that the size and number of GSC nerve balls in the experimental group were significantly reduced compared to the control group. The results of the in vitro limited dilution experiment showed that the self-renewal ability of the neurosphere was weakened after downregulating FTO expression. Flow cytometry detection of apoptosis showed that downregulation of FTO expression increased the apoptosis rate of GSC cells. ConclusionDownregulating the expression of FTO can inhibit the growth and self-renewal ability of GSC， and targeting FTO may be one of the potential strategies to clear GSC.

Key words： FTO; glioblastoma stem cells; neurospheres; apoptosis

基金項目：徐州市科技前沿引领技术基础研究项目（KC21012）

作者单位：221009 徐州，徐州市医学科学研究所（温翠侠）；徐州市中心医院放疗科（温翠侠）；徐州医科大学徐州临床学院（温翠侠）；徐州医科大学研究生院（田聪，王万洲）；徐州医科大学附属医院神经外科（张旭）

通信作者： 张旭

胶质瘤是最常见、恶性程度最高的成人原发恶性脑肿瘤，也是病死率最高的人类恶性肿瘤之一，其中胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）恶性程度最高［1］。目前的治疗方式仍以最大限度手术切除为主，术后辅助放化疗，但疗效仍不理想。GBM的中位生存期受多种因素影响［2］，往往小于15个月，生存率低，预后差［3］。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）应用临床二十余年，是目前临床上一线的化疗药物。但很大一部分GBM患者对TMZ不敏感，并没有显著提高患者的生存［4］。所以迫切需要鉴定GBM新的治疗靶点，研发小分子靶向药物，为临床上GBM治疗提供更有效的治疗方式和策略。

在GBM中存在一小部分具有自我更新和多向分化潜能的胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cells，GSC），往往是导致GBM高度耐药性和放疗抵抗的原因之一，和GBM的发生发展与复发密切相关［5］。与GBM细胞系相比，GSC表现出更强的侵袭，促进血管生成，免疫逃逸等惡性生物学行为的能力［6］。因此，靶向清除GSC，抑制GSC的增殖及其自我更新能力，有利于提高GBM患者的治疗效果，改善其预后。

N6-甲基酰胺（m6A）是发生在腺苷碱基N6位点的甲基化，这是哺乳动物mRNA中最常见、最多样的表观遗传修饰方式［7］。越来越多的研究表明，m6A修饰通过调节致癌或抑癌基因的表达进而影响肿瘤细胞生长，侵袭迁移与凋亡等生物学功能［8-9］。脂肪组织和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）是重要的m6A去甲基化酶，也是第一个被鉴定出的m6A去甲基化酶［10］。研究发现FTO的高表达可以导致GBM对TMZ化疗抵抗［11］。FTO下调可促进肿瘤的EMT转化，增强肿瘤对Wnt信号通路抑制剂的敏感性，此外FTO可以维持白血病干细胞的自我更新能力［12］。这表明FTO是肿瘤治疗的潜在靶点，靶向抑制FTO可能是治疗肿瘤，提高疗效的潜在策略之一。

本研究通过慢病毒系统构建了稳定下调FTO表达的干细胞系，评价了下调FTO表达对GSC增殖、自我更新能力及GSC凋亡等生物学功能的影响。

1材料与方法

1.1主要试剂与材料从临床手术中获得胶质母细胞瘤患者组织，从中分离纯化获得胶质母细胞瘤干细胞GSC。在前期的研究中已验证GSC稳定表达GSC的分子标志物CD133和Nestin。细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）购买于徐州微科曼得生物工程有限公司（Vicmed），FTO抗体购买于Abcam公司，Actin抗体购买于Cell Signaling Technology公司。从上海汉恒生物科技有限公司购买下调FTO基因表达的慢病毒sh-FTO及对照sh-NC病毒，EGF和bFGF购买于美国PeproTech公司。干细胞消化液Accutase、B27和Neurobasal培养基购于美国Thermo公司。Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于美国BD Pharmingen公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养胶质母细胞瘤干细胞GSC接种到含有20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF、2% B27的Neurobasal培养液的培养瓶中，置于37 ℃ CO2恒温培养箱悬浮培养。每隔3 d添加1/3体积的新鲜培养基，待GSC生长成大小适中的神经球，用NeuroCult Chemical Dissociation Kit分离神经球进行细胞传代培养。选取生长良好的GSC用于各种实验。

1.2.2构建稳定下调FTO表达的干细胞株取指数生长期状态良好GSC消化稀释成单细胞悬液，3×105个/孔铺于6孔板，加入病毒液及适量助转剂轻轻混匀。操作后72 h，加入含有3 μg/mL嘌呤霉素的培养基，筛除出被病毒转染上的阳性细胞，直到荧光显微镜下细胞基本全亮。筛选获得的阳性GSC-shFTO与GSC-shNC细胞株应用于后续的WB实验，检测侵染的干细胞中FTO的蛋白表达水平，确定细胞株构建是否成功。

1.2.3Western Blot（WB）实验把处于指数生长状态的细胞消化并吹打为悬液，加入细胞裂解液摇匀后，离心提取上清液并检测蛋白浓度。加入适量体积的上样缓冲液，获得相同浓度的蛋白样本。依据配方把聚丙烯酰胺凝胶加入垂直电泳转印系统，电泳完毕后，用湿电转仪转膜，室温封闭2 h后，用抗FTO的一抗4 ℃孵育过夜。第2天TBST洗膜3次，二抗室温孵育2 h后，TBST再次洗膜3次，加入ECL显影液用蛋白表达成像系统曝光，检测FTO蛋白的表达水平。

1.2.4CCK-8实验将直径约200 μm的干细胞球用Accutase消化成单细胞悬液，按4 000个/孔的细胞数接种于96孔板中，每组重复3个复孔。分别在培养24、48、72，96、120 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，避光孵育30～60 min后用酶标仪检测在波长450 nm处的吸光值（D）。存活率（%）=（实验组D-空白对照D）/（对照组D-空白对照D）×100%。

1.2.5神经球形成实验将直径约200 μm的细胞球用Accutase消化成单细胞悬液，按1 000个/孔的细胞数接种于96孔板中，每组重复3个孔，每3天添加50 μL新鲜培养基，继续培养至6～12 d左右。显微镜下观察神经球大小及数量。对含有50多个细胞的神经球进行评分，计算每孔中神经球的数目，本实验重复3次。

1.2.6体外有限稀释试验将直径约200 μm的细胞球用Accutase消化成单细胞悬液，计数并且按500，100，20，4，1个／孔梯度接种于96孔板，每组重复10个孔。12 d后，观察各实验组肿瘤球形成情况，记录各实验组干细胞成球数目。极限稀释法分析使用在线软件（ttp：//bioinf.wehi.edu.au/ softw/elda/）。

1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡将直径约200 μm的细胞球用Accutase消化成单细胞悬液，按每孔约1×105个细胞接种于6孔板中，培养72 h后收集细胞，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤细胞两次，用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒染色。用流式细胞仪上机检测，用流式分析软件FlowJo分析细胞凋亡情况。

1.2.8统计学分析各实验独立重复3次，所选图表为重复实验的代表性结果。实验结果采用统计软件GraphPad Prism 8.0进行统计学分析。实验结果用均数±标准差（x ±s）表示，两组之间比较采用独立样本t检验，用Graphpad Prism 8.0软件进行作图。以P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2结果

2.1稳定下调FTO表达的干细胞株构建及鉴定通过慢病毒侵染并用嘌呤霉素筛选，获得下调FTO表达的GSC细胞株。分别命名为FTO稳定下调的实验组（Sh1与Sh2）及对照组（NC）GSC，显微镜下观察基本所有干细胞表达GFP绿色荧光。提取蛋白，通过WB实验检测FTO蛋白表达水平。实验组FTO蛋白的表达量较对照组显著降低，表明稳定下调FTO蛋白表达的干细胞株构建成功（图1）。

2.2下调FTO的表达对GSC细胞增殖的影响为了评估FTO对GSC生存的影响，本研究使用CCK-8法检测实验组与对照组在培养24，48，72，96，120 h后的吸光值，分析干细胞生存情况。结果显示随着时间的增加，下调FTO表达的干细胞系生长速率显著降低，表明下调FTO表达能显著抑制GSC的增殖能力（图2）。

2.3下调FTO表达抑制GSC成球能力本研究将实验组及对照组细胞接种6～12 d后，在倒置显微镜下观察神经球的大小和数量。结果显示与对照组相比，实验组的GSC神经球的大小和数量均明显减少，这说明下调FTO的表达会抑制GSC神经球形成能力（图3）。

2.4下调FTO的表达能够有效抑制GSC的自我更新能力本研究采用体外有限稀释实验检测下调FTO对GSC自我更新能力的影响。将实验组与对照组分别处理12 d后，显微镜下观察干细胞成球情况，并计数每组的神经球数量。FTO下调组的干细胞自我更新能力较对照组显著降低，表明下调FTO表达能有效抑制GSC的自我更新能力（图4）。

2.5下调FTO的表达诱导GSC细胞凋亡为了评估GSC的凋亡是否受FTO表达水平的影响，本研究采用流式细胞术检测实验组与对照组的GSC细胞凋亡情况。流式分析结果显示，与对照组相比，下调FTO表达的实验组细胞凋亡率显著增加，凋亡率分别为（9.49±0.72）%和（6.50±0.63）%。以上结果表明下调FTO表达可诱导GSC细胞凋亡（图5）。

3讨论

GBM以恶性程度高、侵袭性强、易复发著称，并且是成人最常见的颅内原发的恶性肿瘤［13］，但其缺乏有效的治疗措施，近年来虽然出现免疫治疗和电场治疗等新型的治疗方式［14-17］，但仍不能替代手术切除加术后放化疗的常规方案［18-19］。近年研究发现，干细胞具有较高的异质性［20］，其自我更新和无限增殖的能力是导致肿瘤放化疗耐药性的重要原因［21-22］。因此，研究针对GSC的调控靶点，设计相关的靶向药，对改善GBM的预后具有重要的意义。本研究证明了下调FTO表达可调控GSC的细胞活性、成球、自我更新、增殖和凋亡功能，进而抑制GSC的生物学功能。

m6A修饰是真核生物中最常见的RNA修饰类型，参与多种细胞内生物进程。通过调节基因表达影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学功能［8］。m6A修饰是一个可逆的动态修饰过程，包括甲基转移酶（METTL3/14），去甲基化酶（FTO/ALKBH5）等多种蛋白参与调控［23］。研究发现敲低METTL3 或METTL14表達可以显著抑制GSC 生长、自我更新和肿瘤发生［24］。而敲除ALKBH5同样可显著抑制肿瘤细胞和肿瘤干细胞的存活［25］。揭示m6A RNA甲基化修饰的异常调控在肿瘤发生发展中发挥重要的作用。FTO是首个被证明的m6A去甲基化酶［26］，研究发现抑制FTO的表达能显著抑制肿瘤的发展并延长干细胞种植小鼠的寿命［27］。另外，FTO抑制剂FB23-2可以显著抑制异种移植小鼠中人类AML细胞系和原代细胞的进展［12］。本研究构建了稳定下调FTO表达的GSC细胞株，通过WB试验验证了FTO的下调效率，结果证实下调FTO表达的干细胞系构建成功。随后，通过CCK-8、神经球形成实验等评价了敲除FTO对GSC细胞生存和自我更新能力的影响。本研究同样发现，下调FTO表达可显著抑制GSC细胞增殖，抑制GSC神经球形成，进而抑制GSC自我更新能力。以上结果提示，FTO是肿瘤治疗的潜在治疗靶点，其抑制剂在临床转化方面具有很好的潜力。

肿瘤的形成不仅与肿瘤细胞快速增殖有关，与肿瘤细胞死亡速度也密切相关。细胞凋亡参与了肿瘤细胞的形成与进程，是抑制肿瘤细胞生长的主要生物学作用，对癌症发生起负调控的作用［28］。相关研究报道，敲除或过表达FTO基因可诱导CoCl2引起的氧化应激，进而促进细胞凋亡［28］。同样发现，抑制FTO活性可通过调控多条信号通路如PI3K/AKT/mTOR、MAPK、cAMP信号促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖［29］。既往研究发现，FTO抑制MYC-miR-155/23a簇-MXI1反馈电路进而导致GBM细胞U87的TMZ抵抗［30］，本研究通过流式细胞术试验检测到，在GSC细胞中，下调FTO表达可诱导GSC细胞凋亡。但FTO在GSC中如何调控细胞凋亡，自我更新等生物学功能还有待进一步研究。

综上所述，下调FTO表达能够有效抑制GSC细胞生存、自我更新、增殖和促进GSC细胞凋亡。本研究为针对FTO靶向清除GSC提供了实验基础，有望提高GBM患者的生存周期。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

［参 考  文  献］

［1］Louis DN，Perry A，Wesseling P，et al.The 2021 WHO Classification of Tumors of the Central Nervous System：a summary［J］.Neuro-oncology，2021，23（8）：1231-1251.

［2］吴维宁，吴有志，刘振，等.高级别胶质瘤患者生存期的影响因素分析［J］.临床神经外科杂志，2020，17（6）：669-674.

［3］Mladenovsk M，Valkov I，Ovcharov M，et al.High grade glioma surgery-clinical aspects and prognosis［J］.Folia Med，2021，63（1）：35-41.

［4］Jia JL，Alshamsan B，Ng TL.Temozolomide chronotherapy in glioma：a systematic review［J］.Curr Oncol，2023，30（2）：1893-1902.

［5］Wang ZY，Zhang H，Xu SC，et al.The adaptive transition of glioblastoma stem cells and its implications on treatments［J］.Signal Transduct Target Ther，2021，6（1）：124.

［6］Kang H，Lee H，Kim D，et al.Targeting glioblastoma stem cells to overcome chemoresistance：an overview of current therapeutic strategies［J］.Biomedicines，2022，10（6）：1308.

［7］Boo SH，Kim YK.The emerging role of RNA modifications in the regulation of mRNA stability［J］.Exp Mol Med，2020，52（3）：400-408.

［8］Sun T，Wu RY，Ming L.The role of m6A RNA methylation in cancer［J］.Biomed Pharmacother，2019，112：108613.

［9］Song N，Cui K，Zhang K，et al.The role of m6A RNA methylation in cancer：implication for nature products anti-cancer research［J］.Front Pharmacol，2022，13：933332.

［10］Li YC，Su R，Deng XL，et al.FTO in cancer：functions，molecular mechanisms，and therapeutic implications［J］.Trends Cancer，2022，8（7）：598-614.

［11］Li XD，Wang MJ，Zheng JL，et al.Long noncoding RNA just proximal to X-inactive specific transcript facilitates aerobic glycolysis and temozolomide chemoresistance by promoting stability of PDK1 mRNA in an m6A-dependent manner in glioblastoma multiforme cells［J］.Cancer Sci，2021，112（11）：4543-4552.

［12］Huang Y，Su R，Sheng Y，et al.Small-molecule targeting of oncogenic FTO demethylase in acute myeloid leukemia［J］.Cancer Cell，2019，35（4）：677-691.e10.

［13］Luo SL，Lei KC，Xiang DX，et al.NQO1 is regulated by PTEN in glioblastoma，mediating cell proliferation and oxidative stress［J］.Oxid Med Cell Longev，2018，2018：9146528.

［14］Brown CE，Aguilar B，Starr R，et al.Optimization of IL13Rα2-targeted chimeric antigen receptor T cells for improved anti-tumor efficacy against glioblastoma［J］.Mol Ther，2018，26（1）：31-44.

［15］Stupp R，Wong ET，Kanner AA，et al.NovoTTF-100A versus physicians choice chemotherapy in recurrent glioblastoma：a randomised phase III trial of a novel treatment modality［J］.Eur J Cancer，2012，48（14）：2192-2202.

［16］Krigers A，Pinggera D，Demetz M，et al.The routine application of tumor-treating fields in the treatment of glioblastoma WHO° IV［J］.Front Neurol，2022，13：900377.

［17］張国栋，鞠海涛，黄平，等.脑胶质瘤的基因治疗与病毒治疗研究进展［J］.临床神经外科杂志，2021，18（2）：237-240.

［18］Klement RJ，Popp I，Kaul D，et al.Accelerated hyper-versus normofractionated radiochemotherapy with temozolomide in patients with glioblastoma：a multicenter retrospective analysis［J］.J Neurooncol，2022，156（2）：407-417.

［19］杜霄，紀环，赵天翼，等.术后长周期替莫唑胺治疗高级别胶质瘤的研究［J］.临床神经外科杂志，2021，18（2）：177-181，187.

［20］Meharwade T，Joumier L，Parisotto M，et al.Single-cell mass cytometry analysis reveals stem cell heterogeneity［J］.Methods，2022，208：9-18.

［21］Wang YL，Xu HN，Liu TR，et al.Temporal DNA-PK activation drives genomic instability and therapy resistance in glioma stem cells［J］.JCI Insight，2018，3（3）：e98096.

［22］Baisiwala S，Hall RR 3rd，Saathoff MR，et al.LNX1 modulates Notch1 signaling to promote expansion of the glioma stem cell population during temozolomide therapy in glioblastoma［J］.Cancers，2020，12（12）：3505.

［23］Liu JZ，Yue YN，Han DL，et al.A METTL3-METTL14 complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation［J］.Nat Chem Biol，2014，10（2）：93-95.

［24］Chang YZ，Chai RC，Pang B，et al.METTL3 enhances the stability of MALAT1 with the assistance of HuR via m6A modification and activates NF-κB to promote the malignant progression of IDH-wildtype glioma［J］.Cancer Lett，2021，511：36-46.

［25］Kowalski-Chauvel A，Lacore MG，Arnauduc F，et al.The m6A RNA demethylase ALKBH5 promotes radioresistance and invasion capability of glioma stem cells［J］.Cancers，2020，13（1）：40.

［26］Dina C，Meyre D，Gallina S，et al.Variation in FTO contributes to childhood obesity and severe adult obesity［J］.Nat Genet，2007，39（6）：724-726.

［27］Chen T，Hao YJ，Zhang Y，et al.m（6）A RNA methylation is regulated by microRNAs and promotes reprogramming to pluripotency［J］.Cell Stem Cell，2015，16（3）：289-301.

［28］Morana O，Wood W，Gregory CD.The apoptosis paradox in cancer［J］.Int J Mol Sci，2022，23（3）：1328.

［29］Zhu YX，Yang J，Li YX，et al.Demethylase FTO enhances the PI3K/Akt signaling to promote gastric cancer malignancy［J］.Med Oncol，2023，40（5）：130.

［30］Xiao L，Li XD，Mu ZK，et al.FTO inhibition enhances the antitumor effect of temozolomide by targeting MYC-miR-155/23a cluster-MXI1 feedback circuit in glioma［J］.Cancer Res，2020，80（18）：3945-3958.

（收稿2023-05-14修回2023-07-01）